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拒食蛋白XnAFP2功能结构域分析与作用机理初步研究

尹富仕  
【摘要】: 拒食蛋白XnAFP2是一种从嗜线虫致病杆菌CB6菌株中分离纯化的毒性蛋白,对多种农业害虫具有拒食、抑制生长发育的作用。为了进一步研究拒食蛋白XnAFP2,本文克隆了拒食蛋白基因xnAFP2,对其进行了功能结构域分析,分别克隆、表达、纯化了各结构域片段,并进行了生物活性测定,得到了拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。同时,还对取食XnAFP2的玉米螟体内主要酶系活性变化进行了测定,为XnAFP2作用机理的研究奠定基础。全文主要研究结果如下: 1.拒食蛋白XnAFP2的基因克隆、表达 通过AKTA分离纯化得到拒食蛋白XnAFP2,利用质谱测序的方法,得到XnAFP2的部分肽段序列,然后进行NCBI数据库比对,根据保守序列设计引物,克隆得到拒食蛋白基因xnAFP2,并尝试对该基因进行表达。 2.拒食蛋白XnAFP2功能结构域的划分与各结构域表达载体的构建 拒食蛋白XnAFP2全长2524氨基酸,对该蛋白进行表达非常困难,为了研究其主效活性区域,对其进行结构域预测和划分,用PCR方法扩增了出3个结构域片段:DomainI,DomainII,DomainIII,并构建了各结构域片段的融合表达载体。 3.拒食蛋白XnAFP2三个结构域的表达与纯化 将XnAFP2三个结构域片段的表达载体转入E.coli BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达,获得了拒食蛋白三个结构域片段的表达蛋白。用蛋白纯化系统(AKTA Explorer10.0)对表达蛋白进行His?Tag亲和层析纯化和脱盐处理,得到纯化蛋白。 4.拒食蛋白XnAFP2三个结构域片段表达蛋白的功能比较与分析 通过拒食蛋白各蛋白片段对棉铃虫、玉米螟、小菜蛾三种幼虫的生长抑制作用的测定,比较分析其功能差异,以期得到拒食蛋白主效活性区域。结果表明,三个蛋白片段对棉铃虫三龄幼虫的生长抑制率分别为17.4%、39.8%和20.2%,对玉米螟三龄幼虫的生长抑制率分别为20.2%、38.6%和21.7%,对小菜蛾三龄幼虫的非选择性拒食率分别为25.7%、44.1%和26.8%。三个结构域片段的表达蛋白对棉铃虫和玉米螟的三龄幼虫均表现出不同程度的生长抑制活性,对小菜蛾的三龄幼虫具有不同程度的拒食效果。其中以Domain II活性最高,无论是对棉铃虫和玉米螟三龄幼虫的相对生长抑制率还是对小菜蛾三龄幼虫的非选择性拒食率,均高于40%;而Domain I、Domain III生长抑制活性或拒食效果较低,均低于27%,与Domain II相比差异显著。因此,Domain II是拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。 5.拒食蛋白XnAFP2对玉米螟体内主要酶系活性的影响 用拒食蛋白XnAFP2饲喂玉米螟3龄幼虫,检测了拒食蛋白对玉米螟生长发育的影响,并通过生化分析研究其对玉米螟幼虫体内解毒酶、保护酶和中肠蛋白酶活性的影响,测定比较了取食XnAFP2后幼虫体内乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和中肠总蛋白酶的活力。结果表明:取食拒食蛋白XnAFP2 (50μg/ml)72h后玉米螟幼虫相对生长抑制率达69.88%,体内谷胱甘肽S-转移酶活力明显低于对照;而乙酰胆碱酯酶活力显著高于对照(3.5倍),保护酶系、中肠总蛋白酶的活性在取食36h后都有一个诱导上升的过程,但随着时间的延长,昆虫生长发育受到明显抑制,体内主要酶系活性都大大降低。


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