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哈茨木霉菌Th-33T-DNA插入突变体库的构建及表型突变株的分析

范亮波  
【摘要】: 哈茨木霉菌是重要的生防真菌,研究其生防相关功能基因对生防机制的认识及高效、稳定的木霉菌制剂的开发具有重要的意义。根癌农杆菌介导的T-DNA标签法是研究基因功能的有效方法。本论文利用根癌农杆菌介导转化技术(ATMT)构建了哈茨木霉菌Th-33的T-DNA插入标签突变体库,并对T-DNA插入突变株进行分析,取得了如下结果: 1.建立了哈茨木霉菌Th-33 T-DNA插入突变体库 确立了稳定、高效的根癌农杆菌EHA105转化哈茨木霉菌Th-33的遗传转化体系,(1)诱导条件:诱导培养前根癌农杆菌EHA105的OD600为0.20~0.30,乙酰丁香酮浓度200 mmol?L-1、pH值5.3,诱导时间6h;(2)共培养条件:共培养时农杆菌EHA105的OD600为0.60~0.80,哈茨木霉菌Th-33分生孢子浓度为105个/mL ,乙酰丁香酮浓度200 mmol?L-1、pH值5.3,24℃共培养48h(3)选择培养条件:温度28℃,培养时间60h。在以上转化条件下,根癌农杆菌EHA105对哈茨木霉菌Th-33的转化效率可达到80~200个转化子/106个分生孢子。利用该转化系统获得了2998株哈茨木霉菌Th-33的潮霉素B抗性转化子。将这些转化子在无潮霉素B的培养基中连续培养三代后,再转接至含有潮霉素B的培养基中,有2956株抗性转化子仍可正常生长,因此可断定该转化系统的假阳性率较低,依此法所建的库中98%以上的抗性菌落为遗传稳定的抗性转化子。 2.从哈茨木霉菌Th-33 T-DNA插入突变体库中筛选产孢突变株 对哈茨木霉菌Th-33 T-DNA插入突变体库中的1999株转化子进行培养和筛选,获得2株产分生孢子显著减少的突变株,编号分别为1413和446,它们在菌落形态、产分生孢子数量、分生孢子器形态等方面与野生型哈茨木霉菌Th-33相比均发生了显著的变化,其中1413号突变株的产孢能力不足野生菌株的1/105,并且几乎不形成正常分生孢子器。 3.从哈茨木霉菌Th-33 T-DNA插入突变体库中筛选株拮抗突变株 采用对峙培养的方法,分别对哈茨木霉菌Th-33 T-DNA插入突变体库中的1999株转化子的拮抗性能进行了测定,筛选出2株对黄瓜立枯丝核菌拮抗能力减弱的突变株和29株拮抗能力增强的突变株。与野生型哈茨木霉相比,拮抗能力增强突变株长满平板并使病原菌菌丝枯萎死亡的时间缩短了10~15h,拮抗能力减弱突变株长满整个平板的时间增长了25h,并且不能使病原菌枯萎死亡。 4.突变株分子生物学检测 对筛选获得的突变株进行T-DNA插入的PCR检测和southern杂交分析,结果表明,T-DNA均已整合进木霉菌基因组中,其中1413号菌株为单拷贝插入产孢突变株,在所检测的突变株中单拷贝插入率为62.5%。 5.产孢相关基因的克隆与分析 利用TAIL-PCR的方法克隆1413号突变株T-DNA的两个侧翼序列,获得长3725bp的产孢相关序列,此序列经Genbank比对分析与染色体组装蛋白基因具有同源性,推测此序列与1413号菌株的产孢突变性状有关。


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