沉默p53基因表达的稳定Vero细胞系的建立及初步应用

【摘要】： p53基因广泛存在于各种动物细胞中,在进化程度不同种属的动物中,p53基因具有异常相似的基因结构。而由p53基因所编码的p53蛋白分子被称之为肿瘤抑制蛋白,具有参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡、参与细胞分化与衰老、抗病毒等多种生物学功能。当细胞受到各种外来应激如射线辐射、缺氧、病原微生物感染时,细胞核内的p53蛋白分子就会被激活,继而激活下游基因的表达,从而产生一系列生物学效应,目的都是为保护细胞基因组免受外来损伤,因此它又被尊称为“基因组的守护着”。 p53的生物学功能如此重要,因此倍受细胞生物学家和医学家的高度关注,为此进行了大量的研究。为研究p53及其介导的信号转导通路在动物病毒感染过程中的作用,本实验首先根据前期实验筛选的一条有效干扰p53基因的小RNA干扰片段,构建针对p53基因的RNA干扰慢病毒载体,将构建好的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒的包装,最后在293T细胞中测定病毒滴度。 将前期包装好的慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞株,采用局部消化法获得单细胞克隆以筛选阳性细胞系,利用RT-PCR和Western blot检测p53的表达水平,利用虫荧光素酶报告系统,分析p53的转录激活功能。结果发现:慢病毒介导的shRNA有效地沉默了p53基因表达;与对照组细胞相比,干扰组细胞的p53的转录激活功能明显降低。因此成功获得了稳定沉默p53基因表达的Vero细胞系。 以建立的稳定沉默p53基因表达的Vero细胞系为模型,将疱疹病毒家族典型代表伪狂犬病病毒( PRV )感染该细胞系,在病毒感染的不同时间点分别收集病毒样品和全细胞蛋白样品,采用TCID50方法测不同时间点的病毒滴度,绘制病毒的多步生长曲线;采用半定量RT-PCR方法测定指示病毒复制的基因的转录水平的变化;采用Western blot方法测定指示病毒复制的基因的翻译水平的变化;分别比较这三项指标在p53-knockdownVero细胞和阴性对照组细胞中的差异变化。结果发现:PRV在p53-knockdown Vero细胞中的复制情况与阴性对照组细胞相比,病毒滴度有所降低,指示病毒复制的基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平也有所降低,尤其在病毒感染晚期,这种变化趋势尤为明显。因此可以初步说明:p53可能在PRV感染宿主细胞的晚期有助于病毒的复制,这为研究PRV与p53介导的信号转导通路之间的关系提供理论依据。 总之,本研究首次采用慢病毒载体介导的RNA干扰技术建立了沉默p53基因表达的稳定Vero细胞系,并且初步应用于动物病毒复制机制中的研究,该细胞系将为研究p53的生物学功能提供有利的工具,阐明p53在某些动物病毒感染过程中的潜在作用机制,从而为研究新型抗动物病毒药物提供理论依据。