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辣椒Me3基因介导抗根结线虫WRKY基因CaRKNIF1的分离及其功能分析

张春秋  
【摘要】: WRKY转录因子广泛参与植物生长发育及对外界生物和非生物的胁迫应答,在植物抗病防卫反应中起着重要的调控作用。近来的研究表明,WRKY转录因子参与了植物与线虫互作应答反应,CaRKNIF1是Me3基因介导辣椒与根结线虫不亲和互作中表达的WRKY转录因子,深入研究CaRKNIF1基因的功能对于揭示Me3基因介导辣椒抗根结线虫的分子机理具有重要意义。本研究以含Me3基因的辣椒HDA149为材料分离得到了CaRKNIF1基因,并通过TRV载体诱导的基因沉默和农杆菌介导的异源超表达,对该基因的生物学功能进行了深入研究。主要结果如下: 1.根据GenBank中已经公布的CaRKNIF1基因(DQ180384)序列信息,分离得到CaRKNIF1基因的全长。CaRKNIF1基因gDNA全长为2387 bp,由3个外显子和2个内含子组成;包含1,473 bp开放阅读框,编码490个氨基酸的蛋白,含有2个保守的WRKY结构域和2个C2H2型锌指结构,属于第Ⅰ组WRKY转录因子。CaRKNIF1基因能够表达出带有His-tag 58 kDa的融合蛋白;洋葱表皮瞬时表达证实CaRKNIF1基因的编码产物是作为核蛋白起转录调控作用的。 2.CaRKNIF1基因的表达具有组织特异性,并且可被多种生物胁迫诱导。RT-qPCR分析发现,CaRKNIF1基因在辣椒HDA149中的表达具有组织特异性,根和叶中表达量较高,花和果中次之,茎中表达量最低;该基因可被根结线虫、青枯病菌、疫霉病菌和烟草花叶病毒等生物胁迫诱导,但表达模式存在差异,疫霉病菌和青枯病菌诱导表达峰出现较早(分别为3 h和6 h),其次是根结线虫(12 h),烟草花叶病毒诱导表达峰出现较晚(48 h)。该基因可能参与辣椒对病原线虫、细菌、真菌和病毒等的胁迫应答反应。 3.构建了CaRKNIF1基因基于TRV的沉默载体,获得了CaRKNIF1基因沉默的辣椒HDA149植株。在CaRKNIF1基因的保守区和特异区设计了3个靶标片段,分别构建了该基因的TRV载体对CaRKNIF1基因进行表达沉默,结果发现TRV载体能够成功侵染辣椒植株并有效引起CaRKNIF1基因沉默,但该基因沉默并没有引起辣椒HDA149对南方根结线虫的抗性发生变化,推测该基因可能与WRKY转录因子家族的其他成员存在功能冗余或者VIGS不彻底而该基因极低转录本即能维持正常的功能。 4.构建了CaRKNIF1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导的植物转化方法获得了转基因番茄植株,抗性鉴定结果表明转基因植株对南方根结线虫的抗性和耐盐能力增强。利用pBI121和pCHF3两套载体系统分别构建了CaRKNIF1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导的转化方法将CaRKNIF1基因导入番茄Moneymaker、Micro-tom和丽春的基因组中。PCR和Southern杂交结果表明,CaRKNIF1基因已成功整合到番茄基因组中;RT-qPCR分析发现CaRKNIF1基因在转基因植株中高量表达。抗性鉴定结果显示:超表达CaRKNIF1基因的番茄植株对南方根结线虫的抗性提高,且耐盐能力增强,表明该基因作为正调控因子参与植物对生物和非生物胁迫的应答。CaRKNIF1基因的超表达能够引起下游PR(PR1/PR2/PR5/NP24)基因的高量表达,推测转基因番茄植株的抗性提高可能与PR基因的组成型表达有关。 5.构建了辣椒HDA149的BAC文库,PCR筛选得到了含有CaRKNIF1和CaMe基因的阳性BAC克隆。辣椒HDA149的BAC文库包含200,000个BAC克隆,平均插入片段大小为95 kb,覆盖辣椒基因组约7倍,预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.9%;利用特异引物PCR的方法,从文库中筛选得到了含CaRKNIF1和CaMe基因的阳性BAC克隆,为研究目标基因的结构与互作调控关系奠定了基础。 综合上述研究结果,WRKY转录因子CaRKNIF1可能作为正调控因子参与了辣椒对生物和非生物胁迫应答反应,利用CaRKNIF1基因来改良辣椒的综合抗病性将是一种颇具潜力的分子育种途径;研究中构建的高质量的辣椒HDA149 BAC文库为辣椒重要基因的克隆和功能分析提供了技术平台,同时也为深入开展辣椒分子标记开发和物理图谱构建工作奠定了基础。


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