产气荚膜梭菌的多重PCR定型及α、β和ε毒素基因的克隆、表达和抗血清的制备

【摘要】： 本试验对产气荚膜梭菌的研究包括三个方面：1、建立了用于产气荚膜梭菌定型的多重PCR方法。2、对产气荚膜梭菌的α、β和ε毒素基因进行了克隆表达。3、用表达的毒素蛋白分别制备了针对产气荚膜梭菌α、β和ε毒素的特异性血清。 根据GenBank已发表的产气荚膜梭菌α，β，ε和ι毒素的基因序列，设计了分别针对α，β，ε，ι毒素基因的保守区的特异性引物，建立了产气荚膜梭菌多重PCR定型方法，其扩增片段的大小分别为202bp、403bp、585bp和291bp。用建立的多重PCR方法对本所保存的140株产气荚膜梭菌进行了定型，并用毒素抗毒素中和试验进行了验证，结果表明，多重PCR定型方法与毒素抗毒素中和试验的定型方法的结果完全一致，证明所建立的PCR定型方法是准确和特异的。与毒素抗毒素中和试验相比，应用多重PCR对产气荚膜梭菌定型具有快速，简单，经济的特点。 根据GenBank已发表的产气荚膜梭菌α，β和ε毒素的全基因序列，设计了分别针对α，β和ε毒素基因完整成熟肽序列的引物，用PCR扩增出了三种毒素的全基因序列的片段，其大小分别为1125bp、942bp和918bp。应用基因克隆和重组技术，成功的构建了含有α，β和ε毒素完整成熟肽基因的表达载体，分别命名为α-pET28a、β-pET32a和ε-pET28a，经PCR、双酶切鉴定和测序鉴定，目的基因的已正确的插入到表达载体中，且目的基因的序列和阅读框架完全正确。 将三种表达载体分别转化到受体菌中，命名为α-pET28a(plys)、β-pET32a(DE3)和ε-pET28a(DE3)。用IPTG对重组菌进行了诱导表达，SDS-PAGE和Western-blotting的检测结果表明，目的基因在受体菌中获得了表达且具有反应原性，重组α，β和ε蛋白的分子量分别约为46.1kDa、54.6kDa和36.6kDa，与预期的分子量大小相符。对重组菌的表达条件进行了优化，并对其表达形式和表达量进行了确定，结果表明，重组α、β和ε毒素蛋白在大肠杆菌的细胞质、周质和胞外均获得了表达，其中重组α、β毒素蛋白主要以包涵体的形式表达，没有天然毒素的毒性，表达量分别占到了菌体总蛋白的38.3％和24.6％；重组ε毒素蛋白主要在周质中以可溶性蛋白的方式表达，具有天然活性，其表达量占到了菌体总蛋白的29.3％，经0.3％的胰酶活化后，其每毫升菌液获得的ε毒素含有15000个小鼠MLD，其毒力与D型产气荚膜梭菌(C60-2)的毒力相近。 分别用重组α、β和ε毒素蛋白免疫家兔，制备了其特异性血清，并用毒素抗毒素中和试验测定了其中和效价，结果表明，每毫升α毒素抗血清可以中和100个MLD的A型毒素，每毫升β毒素抗血清可以中和500个MLD的C型毒素；每毫升ε毒素抗血清可以中和30000个MLD的D型毒素。