猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位研究

【摘要】： 猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。CSFV编码的结构蛋白中，囊膜糖蛋白E2是其主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体，是研制CSF诊断试剂和新型疫苗的首选靶蛋白。由于疫苗毒株和流行毒株之间在抗原特性和致病特性方面都存在着一些差异，而这些差异是否与CSFV的主要保护性抗原-E2蛋白有关，成为了人们关注的热点问题。业已证明，在E2蛋白上存在两个蛋白表位TAVSPTTLR和YYEP，以及一个模拟表位TTWKEYSH，还有一部分表位有待于进一步认识和定位。 本研究选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株，分别扩增这两株病毒的E2基因，通过DNaseⅠ随机酶切得到20-125bp的小片段，采用噬菌体展示技术将其克隆入T7select415-1b载体，构建了CSFV SM株E2基因噬菌体展示多肽库(SM-E2库)和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(HCLV-E2库)，库容量分别为6.6×10~5pfu和3.2×10~5pfu，其容量符合要求。 通过生物淘选和噬菌体的原位杂交技术，采用7株单克隆抗体1834-37-9、4830-3-1、F105、F108、M56、M11、1E2和猪瘟高免血清CSFV Ab分别对上述构建的SM-E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛选。单克隆抗体F105、F108、高免血清从SM-E2库中，1834-37-9从HCLV-E2库中，M11、1E2从SM-E2库、HCLV-E2库中都筛选到与TAVSPTTLR高度同源的序列；猪瘟高免血清从SM-E2库中筛选到了与YYEP高度同源的序列；同样高免血清从HCLV-E2库中也获得了与模拟表位TTWKEYSH高度同源的序列。此外，单抗4830-3-1在SM-E2库和HCLV-E2库中分别筛选到与E2氨基酸序列GGQ(V)VK(887aa～891aa)高度同源的序列；单抗M56在HCLV-E2库中筛选到与HCLV E2氨基酸序列PDGLPHY(903 aa～909aa)高度同源的序列。TAVSPTTLR、YYEP和TTWKEYSH序列与目前已知E2蛋白表位一致，说明它们是E2蛋白上的优势表位和模拟表位；GGQ(V)VK和PDGLPHY序列与预测表位一致，推测是E2蛋白上潜在抗原表位。 本研究首次构建的CSFV SM-E2和HCLV-E2基因的特异性噬菌体多肽库，与噬菌体随机多肽库相比，更能特异地反映CSFV E2基因表位信息；为CSFV E2蛋白新的表位研究奠定了基础。