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侧柏古树抗衰老分子机理研究

常二梅  
【摘要】:古树寿命长达几千年仍不见衰老,其生理与分子调控机制如何?成为近年来植物抗衰老研究领域的热点之一;而活性氧(ROS)的动态平衡被认为是影响植物衰老的主要因素之一。本文2010年以陕西黄帝陵树龄为20yr和3000yr侧柏(Platycladus orientalis)叶片为研究材料,在对ROS生成与清除机制研究的基础上,通过Solexa高通量测序技术进行转录组和表达谱测序分析,发掘与树龄相关的差异表达功能基因;并应用实时定量qRT-PCR技术,集中研究ROS动态平衡相关基因在侧柏幼苗受到NaCl、ABA胁迫时基因表达模式的变化情况,从而探讨ROS清除机制在侧柏抗衰老机制中的贡献。主要结论如下: (1)通过对20yr和3000yr侧柏H_2O_2和相关清除系统研究表明,3000yr侧柏叶片H_2O_2含量在生长季中高于20yr,而季末低于20yr;但3000yr侧柏谷胱氨酸还原酶(GR)活性及谷胱甘肽(GSH)含量在季中明显高于20yr侧柏,而超氧化物歧化酶(SOD)活性及抗坏血酸(AsA)含量基本没有变化;同样,3000yr侧柏在季末的ROS清除能力高于20yr。另外,研究还发现3000yr侧柏种子萌发过程中仍具有较高的ROS清除能力。结果说明,3000yr侧柏可通过较高水平的H_2O_2清除能力使细胞免受或减轻伤害,这可能是其抗衰老的主要生理机制之一。 (2)采用Solexa测序技术对20yr和3000yr侧柏叶片进行转录组测序,总共进行了13,600,516次读数,经组装得到363,885个Contig,68,219个独立的Scaffold;进一步拼接后共获得51,664个Unigene,平均长度为475bp。另外,通过对侧柏叶片转录组中进行SSR位点的发掘,发现了含SSRs的序列703条,共742个SSRs,SSRs出现的频率为1.36%。这些Unigene对侧柏进行抗衰老研究提供了重要基因资源。 (3)选择10个侧柏候选内参基因,通过qRT-PCR分析其在不同树龄、不同组织、不同胁迫(ABA、NaCl、PEG、冷、热胁迫)时基因表达变化,利用Ct值通过geNorm、NormFiner和BestKeeper软件分析这些内参基因的表达稳定性。结果表明:UBC和aTUB在不同树龄、不同组织、不同处理表达稳定。 (4)在转录组序列的基础上,利用Solex技术对20yr与3000yr侧柏叶片建立差异表达谱。通过严格筛选,发现在3000yr VS20yr侧柏中满足FDR≤0.001,而|log2Ratio|≥1的差异表达基因共有1202个,其中上调基因578个,下调基因624个。并利用qRT-PCR对12个差异表达基因进行表达模式验证,结果与表达谱测序结果基本一致。然后,根据功能对不同树龄差异基因进行分类,依次分为:信号传导、激素、转录因子、蛋白质降解、ROS清除、衰老相关、胁迫响应与抗逆、次生代谢、其它代谢、未知或预测蛋白等类别,这些基因可能使3000yr侧柏通过调节体内生理生化变化来抵御各种逆境。 (5)通过对ROS清除相关基因NAC、NQO、POD、DXS、PAL、GAD、SSADH、GABA-T、TDB、TRF1在外源ABA、NaCl胁迫下基因表达分析表明,除SSADH在NaCl和TRF1在ABA胁迫下表现为基因表达水平先受到明显抑制,随后逐渐增强;其余基因则是随着胁迫时间延长,基因表达水平先明显升高,后逐渐降低或保持较高水平,并且与H_2O_2含量成正相关关系,表明这些基因可能在侧柏胁迫响应过程中对ROS动态平衡起到调控作用,从而间接说明这些基因可能在侧柏古树ROS清除机制中具有重要作用。 综上所述,本研究在不同树龄侧柏ROS清除系统测定分析的基础上,首次利用Solexa高通量测序技术对侧柏叶片的转录组及不同树龄的表达谱进行测序分析,发现在信号转导、转录因子、ROS清除、抗逆、次生代谢等差异表达基因中,3000yr侧柏中有许多相关基因的表达量高于20yr侧柏,说明这些基因对3000yr侧柏抗衰老机制具有重要作用;并通过集中分析ROS动态平衡相关基因在胁迫响应中表达模式变化,探讨ROS调控对侧柏抗衰老分子调控机制的贡献。因此,本研究不仅对保护古树、减缓其衰老的意义重大,而且对林木、作物或花卉抗性遗传改良和分子育种具有参考价值。


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