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山茶花APX、CPI、GA20ox1基因功能研究及木糖筛选体系建立

王江英  
【摘要】:利用RT-PCR同源克隆以及3’,5’-RACE扩增技术,从杜鹃红山茶(Camellia azalea)嫩叶中分离获得山茶花抗逆基因以及从云南山茶矮生品种‘恨天高’(C.reticulate Lindl.‘Hentiangao’)茎尖中分离获得株型生长相关的同源基因c DNA全长序列,所分离的基因包括杜鹃红山茶CaAPX(GenBank登录号:KP635267)、杜鹃红山茶CaCPI(GenBank登录号:KP635269)以及‘恨天高’CrGA20ox1(GenBank登录号:KP635268)。序列分析及生物信息学分析发现,这些基因皆为所要分离的目的基因。利用荧光定量Real-time RT-PCR技术,分别对CaAPX、CaCPI以及CrGA20ox1的表达模式进行了研究。CaAPX在杜鹃红山茶7种检测组织中均有表达,但表达水平不一,表达量由高到低依次为:未成熟果实嫩叶花苞叶芽种胚花瓣花芽,其中未成熟果实中的表达量最高,高达其他组织的2.68~11.44倍。杜鹃红山茶在温度胁迫下的表达分析结果显示,温度胁迫可以诱导CaAPX表达量增加。CaCPI在杜鹃红山茶嫩叶中的表达量最高,其次为茎,而根的表达量则较低,约为嫩叶的0.62倍。GA20ox1基因在4种不同株型的山茶中均得到表达,其中乔木类的浙江红山茶(C.chekiangoleosa Hu)GA20ox1表达量最高,其次是岳麓连蕊茶(C.handelii Sealy)及金花茶(C.nitidissima Chi),表达量最低的为矮生品种‘恨天高’,由此推测该基因的表达量高低与测试物种的株高有呈现正相关的趋势。GA20ox1在4个物种不同组织中的表达模式基本一致,且茎尖组织中的表达量均高于叶片中的表达量,表明茎尖GA20ox1表达情况是决定株型高矮的主要因素之一。通过酶切、连接的方法,利用pBI121表达载体,分别构建了3个正义植物表达载体和1个反义植物表达载体,分别为正义CaAPX、正义CaCPI以及正、反义CrGA20ox1基因的表达载体。农杆菌介导,分别转化烟草(Nicotiana tabacum L.cv.SR1),其中含正义CaAPX、正义CaCPI和正义CrGA20ox1基因的转化阳性烟草各20株,含反义CrGA20ox1基因的转化阳性烟草20株,共计获得80株阳性植株。从以上经过PCR鉴定为阳性的植株中各挑选3株,经Southern杂交鉴定,均为阳性,说明目的基因成功整合至烟草基因组中。荧光定量Real-time RT-PCR分析表明,正义基因转化烟草阳性株系中的目的基因表达量显著提高,其中正义CaAPX转化烟草叶片CaAPX表达量高达82.44;正义CaCPI转化烟草叶片CaCPI表达量高达95.23;正义CrGA20ox1转化烟草叶片CrGA20ox1表达量高达108.02,而反义CrGA20ox1转化烟草叶片表达量只有野生型的0.44倍。温度胁迫后发现,过量表达正义Ca APX可以提高转基因烟草的抗寒、耐热性,以及在温度胁迫下,转基因烟草植株体内与抗寒、耐热能力呈正相关的指标增加趋势较野生型明显,而与抗寒、耐热能力呈负相关的指标增加趋势则低于野生型。PCR检测显示CaAPX在T0及T1代稳定遗传,温度胁迫下提高种子的抗寒、耐热性及种子发芽率。正义CaCPI转化烟草阳性植株T1代幼苗经PCR扩增显示,CaCPI在T0和T1代之间能够遗传表达。喂虫实验结果显示,野生型烟草不能抵御同翅目桃蚜(Myzus persicae),过量表达正义CaCPI转基因烟草则对蚜虫具有较好的抵御能力,接虫5d后植株上的蚜虫积累死亡率高达野生型的5.14倍。经形态指标检测结果可以看出,过量表达CrGA20ox1烟草植株明显增高,而沉默表达CrGA20ox1烟草株高约为野生型的一半。内源激素测定显示,正义表达CrGA20ox1提高烟草内源激素GA、IAA含量,而反义表达CrGA20ox1则抑制GA、IAA的合成;内源激素ZR和ABA在正、反义CrGA20ox1转化烟草体内均变化不明显。木糖筛选系统应用到烟草转化中结果表明,xyl A标记基因可以替代卡那霉素应用于烟草转化体中,且效果更优。以杜鹃红山茶带柄叶片、茎段、子叶为外植体诱导的愈伤组织,生长状态均表现良好,愈伤组织启动诱导的日期比对照组提前约10d,生长量为对照组的1.5~2.5倍。可以认为25g/L的木糖浓度是适合杜鹃红山茶愈伤组织诱导及生长的筛选浓度。


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