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盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究

秦媛  
【摘要】:植物(林木)可与土壤微生物形成多种不同类型的共生系统以适应复杂的生存环境。除根瘤菌和菌根真菌等典型根系微生物共生体之外,在多种生境及土壤类型条件下,植物体内外还蕴含着内生真菌、内生细菌、根际促生细菌等大量新颖且遗传多样化的共生微生物。这些共生菌可参与宿主多种生理生态过程,并对其功能性状(包括促进营养元素高效吸收、提高抗逆性等)进行调控。近年来,高通量测序技术的快速发展逐步揭示植物根际共生微生物群落组装机制和核心菌群。但是,目前我们对这些共生菌的功能,及其在林木生长和适逆调控效应上的认识还十分有限。本研究以不同地区的多种盐生植物及其根际土壤共生微生物为主要研究对象,以构建毛白杨(Populus tomentosa)、NL895杂交杨(P.deltoides×P.euramericana)、北美枫香(Liquidambar styraciflua)等多种类型的林木-微生物新型共生关系为目标,采用以接种试验验证功能为主的正向筛选和以宿主表型为靶标的反向筛选两种策略,基于分离培养和高通量测序技术,揭示功能菌株以及微生物群落在介导林木生产力和生态适应性方面的作用,主要研究成果如下:(1)格孢腔目(Pleosporales)真菌遗传多样性和促生功能研究:从多种盐生植物根部、根际以及种子等部位分离培养获得大量格孢腔目真菌,选取其中27个代表性菌株,基于SSU,LSU和tef1三个基因片段进行系统发育分析,结果表明这些菌株隶属于7个科,遗传多样性丰富,且其中9个菌株形成一个相对独立的进化分支(可能代表一个新的科)。体外耐性测试结果表明大多数菌株虽不嗜盐,但具有较强的耐盐性和耐碱性,在KCl浓度1.6M、山梨醇浓度2.0M或pH10的环境下仍可生长。模式植物共培养试验表明,在培养机制氮源为无机氮的条件下大部分菌株对植物无明显促生效应,甚至有抑制作用,相反,在有机氮条件下,绝大多数菌株可显著促进植物地上部分生物量的积累。显微染色观察发现部分菌株可成功侵染植物根系并在皮层细胞中形成暗色的菌丝和类似微菌核的结构,是暗色有隔内生菌(dark septate endophytes,DSEs)的典型侵染结构,具有矿化有机质(氮)的能力,促进宿主氮素吸收。其中,弯孢霉菌(Curvularia sp.)对北美枫香和杨树幼苗的生长和耐盐具有显著促进作用,是一类可用于林木促生抗逆的优质微生物资源。(2)盐地碱蓬(Suaeda salsa)种子际真菌群落结构分析及芽孢霉菌(Cladosporium cladosporioides)生态学特性研究:基于焦磷酸测序技术发现碱蓬种子真菌群落的物种多样性较低,其中枝孢属真菌(Cladosporium sp.)为优势菌群。同时,通过培养手段从种子内部分离得到该属真菌芽孢霉(C.cladosporioides),接种试验证明该菌可以显著提高碱蓬种子萌发率,除宿主植物外,浓度为1×105 ml-1的芽孢霉孢子悬浮液也可对北美枫香幼苗产生显著促生作用,结合多个试验数据推测芽孢霉可从土壤转移至地上部分,成为种子优势内生菌,说明其具有林木广谱共生菌的特性。(3)根际和内生细菌的培养及产ACC脱氨酶细菌的快速筛选:将从不同盐生植物以及杨树根际、根系等部位分离和纯培养所得247株细菌进行分子鉴定,并利用PCR技术对编码ACC脱氨酶的acdS基因进行扩增和克隆测序。在试验过程中,共使用acdSf3/acdSr4、DegACCf/DegACCr和F1936f/F1938r三对引物,经比较和筛选,选用特异性条带最少、扩增成功率最高的引物对acdSf3/acdSr4,最终获得25株可编码ACC脱氨酶蛋白的细菌,分属于无色杆菌(Achromobacter sp.)、伯克氏菌(Burkholderia sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、盐单胞菌(Halomonas sp.)贪铜菌属(Curiavidus sp.)以及多嗜菌属(Variovorax sp.)等六个类群。本试验建立了一套行之有效的方法,用以快速筛选具有提高盐生植物和杨树耐盐能力的功能细菌。(4)土壤微生物组几种提取方法的比较研究:经16S rRNA、ITS扩增子高通量测序分析、BIOLOG ECO和FF微孔板分析、可培养真菌、细菌菌落(cfu)计数等分析手段,比较使用超声波、搅拌器进行物理分散,或使用焦磷酸钠、吗啉乙磺酸一水合物溶液作为化学分散剂等四种不同处理后,提取所得的菌体与原始土样中真菌和细菌物种多样性、群落结构特征及微生物群落水平生理代谢特征的差异。结果显示不同处理提取所得微生物与原始土壤中微生物类别均有一定差异,其中焦磷酸钠处理和搅拌器两种处理相对较好,可将两种方法相结合来高效提取土壤整体微生物组样品,并用于后续根际微生物组工程试验体系中。(5)促生耐盐林木根际微生物组工程体系的建立和功能初步研究:以两种杨树无性系幼苗作为实验材料,提取富集同域(源于杨树良种基地)和异域(源于滩涂盐碱地)生境土壤微生物组样品,依次建立全封闭、半封闭以及全开放式共培养体系,探究两种土壤微生物菌群及其组合对杨树幼苗生长和耐盐能力的影响。初步结果表明,土壤微生物组接种后对杨树幼苗的生长无明显抑制,并可在一定程度上促进幼苗生长并提高其耐盐性。随后,选择具有强耐盐表型的杨树幼苗,提取其根际微生物组进行多轮筛选,以期获得功能稳定的菌群,为共生微生物人工合成群体的构建提供新的思路,同时也为创制新型林木促生适逆混合菌剂奠定理论基础。


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