兰科菌根真菌多样性研究及其对兰科植物的影响

【摘要】：菌根(Mycorrhiza)是自然界植物在长期的生存过程中与真菌共同进化而形成的一种普遍存在的共生现象。兰科植物(Orchidaceae)是典型的菌根植物,几乎所有的兰科植物都与真菌共生,菌根共生关系几乎伴随着兰科植物从种子萌发到开花结果的整个生活史。开展兰科菌根真菌多样性及其对兰科植物生长影响研究,对兰科植物与真菌之间关系和共生分子机制的研究,兰花资源保护、野生种群的生态恢复及产业化经营具有重要意义。本研究对11种兰属(Cymbidium)和41种石斛属(Dendrobium)植物共生真菌进行了分离和鉴定,分析和讨论了样本间菌根真菌多样性差异及与兰科植物的专一性关系;以多种兰科植物和兰科菌根真菌为研究对象,在组织培养条件下构建了真菌与兰科植物种子、根状茎(原球茎)和幼苗的共生体系,筛选对兰科植物的生长有促进作用的菌根真菌,并以此为基础讨论了植物与真菌的专一性关系;运用生物信息学分析方法,预测和分析了小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis)和铁皮石斛(Dendrobium officinale)与菌根真菌共生相关的Ca M和CML基因家族。主要研究结果如下:(1)从11种兰属植物中共分离获得1450株兰科菌根真菌,属于22个OTUs,分布在胶膜菌科(Tulasnellaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)和蜡壳耳科(Sebacinaceae)中;其中物种丰富度最大为四川建兰菌根(7个OTUs),物种丰富度最小为浙江蕙兰、贵州春兰和湖南春兰(2个OTUs)。(2)从41种石斛属植物中共分离获得1434株兰科菌根真菌,属于48个OTUs,分布在胶膜菌科、角担菌科和蜡壳耳科中;物种丰富度最大为滇桂石斛(7个OTUs),物种丰富度最小的为短棒石斛、紫瓣石斛和高山石斛(仅1个OTU)。(3)利用单因素方差分析(ANOVA)和非参数多元方差分析(PERMANOVA)对不同的植物样本间的菌根真菌在群落结构差异进行了研究。专一性研究结果发现,本研究供试的11种兰属植物和35种石斛属植物在植物种的层次、地理分布层次、生长环境层次、生长发育类型层次上与菌根真菌存在专一性关系。(4)筛选获得真菌与兰科植物建立共生关系最适培养基浓度。胶膜菌科真菌在4.0 g/L OMA浓度培养基中更适合与供试兰科植物建立共生关系,其中Tcs1菌株可与全部供试兰科植物在全部燕麦培养基浓度下建立共生关系;角担菌科真菌在0.25 g/L浓度培养基中更适合与供试兰科植物建立共生关系;蜡壳耳科真菌在12.0 g/L浓度培养基中更适合与供试兰科植物建立共生关系。(5)筛选获得4株对兰科植物种子萌发具有促进作用的菌根真菌及相应最适培养基浓度。Tcs1菌株可以促进所有兰科植物种子萌发;而所有兰科植物的种子接种Tsg1菌株或See菌株的GI值和萌发率均为0;兜兰种子仅能和Tcs1菌株成功建立共生关系;硬叶兰及铁皮石斛种子只能与角担菌科真菌在较低OMA浓度下建立共生关系;方差分析表明,在同一OMA浓度条件下,不同菌株对兰科植物GI值和萌发率的影响均存在极显著差异;接种同一菌株,不同浓度燕麦培养基对同一兰科植物GI值和萌发率影响显著性不同。(6)筛选获得6株对兰科植物根状茎(原球茎)的生长发育具有促进作用的菌根真菌。其中,硬叶兰、建兰和铁皮石斛分别与Tcs1菌株共培养30天后,平均鲜重净增率最高可达203.47%(2.0 g/L OMA)、170.65%(8.0 g/L OMA)和168.55%(8.0 g/L OMA)。(7)筛选获得6株对兰科植物幼苗的生长有促进作用的菌根真菌。硬叶兰、建兰和铁皮石斛分别与Tcs1菌株共培养30天后,平均鲜重净增率最高可达179.01%(2.0 g/L OMA)、158.84%(2.0 g/L OMA)和167.51%(4.0 g/L OMA),且定殖率均为100%;Tof4菌株(8.0 g/L OMA)与铁皮石斛幼苗存在一定的专一性关系。(8)利用生物信息学方法对小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛Ca M和CML基因家族进行分析。在小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛基因组中均预测到4个Ca M蛋白和54个CML蛋白;系统进化分析将其各分为10个亚家族;小兰屿蝴蝶兰中9个基因在叶中的表达相对于花、茎、根为上调表达,2个基因在叶中的表达相对于花、茎、根却为下调表达;铁皮石斛中4个基因在共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为上调表达,4个基因在共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为下调表达。表明Ca M和CML基因家族可能参与铁皮石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发中的生物学调控。