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水仙转化系统的建立与Agamous基因的克隆及油菜素内脂应答基因鉴定与分析

汪政科  
【摘要】:中国水仙(Narcissus tazetta-Var Chinensis)花乳白色,是我国传统名花。 水仙是一种单子叶鳞茎花卉,低温条件下进行营养生长,高温时地上部分死亡, 较大的鳞茎进入花芽分化。过去的学者主要是对水仙的快速繁殖和辐射处理后 形态差异进行了研究,尚无关于花发育和花卉基因工程等方面的研究报道。 通过愈伤组织再生植株,建立一个高效的再生体系是基因工程的基础。 研究发现水仙进行组织培养时必须经过40~60天左右的低温处理,否则外植体 极易死亡;低温时间太长,则易受真菌感染。通过对9种类型2700块外植体在 8种不同植物激素配比的培养基上愈伤诱导和形成情况研究发现花芽是最好的 外植体,愈伤诱导培养基是MS+BA0.2mg/1+ 2,4-D1.0mg/1+ NAA0.2mg/1。形成 愈伤以后将其再转入分化培养基(6-BA0.1mg/1+2,4-D0.5 mg/1 +NAA0.2mg/1) 培养基上继代培养,愈伤组织在分化培养基(MS+6-BA1.0mg/1+2,4D0.05 mg/1 +NAA0.2 mg/1)上可以分化出 8-12个小鳞茎。为了建立水仙遗传转化体系,通过 在培养基中添加卡那霉素和潮霉素发现,在添加潮霉素 20 mg/1以上的培养基上 愈伤生长受阻,出现褐化现象,并逐渐死亡。因此潮霉素20mg/1可以作为水仙 转化的筛选选择压进行水仙的遗传转化,从而首次建立了水仙的遗传转化体系。 为了通过遗传工程的方法改变水仙花的形态,提高观赏价值,进行了从 水仙花中克隆对花形态发育有重要调控作用的Agamous同源基因。 用拟南芥的Agamous作探针,进行水仙低严谨Southern印迹杂交,结果在 尼龙膜上有杂交的谱带,说明水仙与拟南芥的Agamous基因存在一定同源性。 利用巢式兼并引物的RT-PCR方法,从水仙花序mRNA中扩增出350bp,500hp, 750bp的 3条片段。测定并分析了 350bp 和 750bp两个片段,结果发现350bp RT-PCR产物与其他植物的Agamous基因的同源性很高。根据该段cDNA序列, 设计巢式引物做3'RACE和5'RACE。5'RACE扩增出3条片段,长度分别750bp 和 1000bp,2100bp。3'RACE扩增出 2条片段,长度分别 500bp和 2100bp。测 定了 5’RACE的 750hp和 3’RACE的 500hp片段的序列,结果这两个序列与其 他植物的 AgQmous基因的 cDNA序列有很高的同源性。这两个序列有 200 hp完 全一致的重叠区。获得了一个长度为1320hp完整全长CDNA序列的序列,有一 个开放的阅读框,编码230个氨基酸。氨基酸序列比较发现与其它植物的 AgQmous基因在MADS区56个氨基酸中只有1~2个氨基酸序列不同,可以形 成H级结构的保守区M、all、6I、611区,与其它植物的 AGAMOUS同源基 因的序列完全一致,但在aZ区存在一些差别。因此可以确定我们己经从水仙中 克隆AgQmous基因。该基因在与由兼并引物扩增的片段几乎完全一致但在一段 23hp的序列有4个碱基不同可以推断是该基因结构类似的等位基因。水仙 AgQmous基因的克隆奠定了对水仙花型进行遗传改变的物质基础。 通过花芽形态观察,发现在7月20日花序原基形成,第一个花芽己分化, 花芽的花冠己经形成,但雄蕊和雌蕊尚未形成。这比有关文献报道的时间要早。 油菜素内酯①L)对植物的生理功能有多种影响:细胞伸长与分裂,生殖和 维管束的分化。它还影响光合作用能力和其它内源激素的平衡等生理作用。BL 还具有提高种苗生长,减少表型差别,提高生物量,促进增产,提高植物抗逆 性。BL生物合成缺陷突变体,它们的共同特征是植株矮小,下胚轴粗短,莲座 紧凑,子叶张开,叶深绿色,向上生长,根少。虽然油菜素内酯具有广谱的生 理功能,但其作用的分子机制尚不清楚。为了大规模鉴定和分离高等植物对BL 处理响应的基因,并进一步研究其对植物生长发育的调控机理。首次通过cDNA army的方法,我们从 13,000个克隆中筛选出引个 BR应答基因。与 GeneBank 资料库进行同源性比较,可以将油菜素内酯处理后表达差异的基因分为四个主 要类型:与细胞分裂有关的基因;与RNA合成或转录表达等的信号传导有关的 基因;与逆境反应有关的基因;其它功能未知的新基因。研究发现与细胞分裂 有关的三个基因的表达发生了改变,Cyc3的表达升高,MyB七he和 MloZ的表 达下降:HSp和 CyCIOphilill是植物中重要的分子伴侣,是逆境条件下信号传导 或蛋白折叠的一个重要的酶。研究发现两个 HSp90基因家族的热激蛋白 HSpsl 且邑和 HSP82在 Br处理后表达量升高了。


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