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杨树木质素合成酶PAL基因的克隆、鉴定及其表达载体的构建

薛永常  
【摘要】: 杨树是我国重要的造林树种,由于它速生、木材是纸浆优良的原材料而引起人们的广泛关注。我国杨树资源非常丰富,如何定向改良我国现有的杨树,培育工业用材林新品种,提高木材的利用率,解决我国木材短缺的现状是林木遗传育种工作者的首要任务。本文主要在杨树木质素生物合成酶基因苯丙氨酸氨解酶(PAL)的克隆、测序、鉴定以及其表达载体的构建方面开展了一些工作。 PAL是木质素生物合成途径中涉及到的第一个酶,它的丰度直接影响着生物体内木质素及许多酚类物质的代谢,因此对PAL进行基因操作具有重要的实际意义。我们在国内首次利用RT-PCR从杨树次生木质部提取的mRNA中扩增并克隆出木质部特异表达的PAL基因片段,并且利用pBI 121和pBin438构建了其表达载体,并做了初步的转化研究。我们取得的初步结果有: 1.通过引物分析软件,首先设计合成了用于PAL扩增的正向及反向引物,通过对杨树叶片DNA的特异PCR扩增,我们能够扩增出大小约600bp左右的单一DNA片段条带,这和我们所设计的片段大小基本相当,从而证明我们所设计的引物是正确的、实验条件是可行的。 2.我们在国内首次利用RT-PCR技术从杨树次生木质部提取的mRNA中扩增出一个大小为565bp的木质素合成特异表达的PAL基因片段。 将其克隆到pGEM-T Easy载体上,获得了重组质粒。通过对该重组质粒进行了限制性内切酶酶切、PCR扩增以及序列测序分析,证明我们插入到载体上的片段即是我们所扩增出来的DNA片段;通过和Osakabe Y等(1995)在EMBLWP=5核酸序列库中发表的白杨杂种(Populus kitakamiensis)PAL的cDNA序列(D30656)比较,二者的前400个碱基几乎完全相同,其同源性高达95%以上,从而证明我们所扩增出来的DNA片段即为PAL基因片段的一部分。我们将此质粒定名为pGEM-T -PAL质粒。 3.通过对pGEM-T-PAL质粒和载体pGEM-7Zf(+)进行EcoR I单酶切,分别得到PAL片段和pGEM-7Zf(+)片段。利用CIAP对pGEM-7Zf(+)的EcoR I单酶切片段进行脱磷酸化处理后,将二者进行连接,构建了PAL的中间载体——pGEM-7Zf(+)-PAL质粒,经测序分析PAL片段是以正向插入到pGEM-7Zf(+)酶切位点的。 4.同时对pGEM-7Zf(+)-PAL质粒和pBI 121载体进行Xba I和BamH I双酶切;对pGEM-7Zf(+)-PAL质粒和双元载体pBin438也进行Xba I和BamH I双酶切,然后分别进行连接,构建了表达载体质粒pBI121-PAL和pBin438 PAL。 5.将表达载体pBI121-PAL和pBin438 PAL转化农杆菌LBA4404,经对从农杆菌中提取的质粒分别进行特异引物扩增,能扩增出600bp的目的片段,证明表达载体已经转入了农杆菌。然后利用农杆菌转染杨树叶片和嫩茎,期望能得到转基因植株。 6.作为该项目总体目标的前一部分,我们基本完成了载体的构建工作。下一步就是转基因植株的组培、分子生物学鉴定以及转基因植株的木质素测定工作,希望能达到木质素含量或木质素组成上发生改变的植株,为社会创造出巨大的经济效益和社会效益,为我国杨木的材性改良做出贡献。


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