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杨树基因枪多基因共转化研究

纪丽丽  
【摘要】:杨树(Populus L.)既是世界上重要的经济树种,又是林木基因工程研究的模式树种。目前,杨树遗传转化研究已取得了重大进展,获得了抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱耐盐碱及材性改良的转基因植株,但基本上是导入单个基因的报道,且导入单个基因往往只能获得部分抗性。要想获得具有多抗的杨树新品种,进行多基因共转化是一条值得尝试的途径。 本研究以杨树优良品种108杨(P.×euramericana‘Guariento’)、中林46杨(P.×euramricana (Dode) Guineir cv. ‘zhonglin-46’)、半常绿杨(P.detoides ×P.nigra cv.Chile )以及银中杨 (P.alba×P.berolinensis)和银腺杨(P.alba×P.glandulosa)为受体,利用基因枪将透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)、果聚糖基因(SacB)、调节基因(JEF36#)、双价抗虫CryⅢ+Oc-Ⅰ多个基因同时导入受体细胞,经PCR分子检测,获得了多个呈阳性的多基因和单基因转化植株。同时还对离体叶片植株的再生培养条件、卡那霉素选择压以及基因枪轰击参数进行了较为系统的优化研究。主要的研究内容及结果如下: 1、欧美杨组培环境条件的优化。本文研究了光照时间、培养基组分和最适pH值对杨树组培苗生根和生长的影响。研究结果表明光照时间长短、活性炭的含量对植株的生长影响很小,而培养基pH值高低对其则有很大的影响。欧美杨组培苗生根及生长最佳生长的培养基pH值为7.0。 2、欧美杨高频植株再生体系的建立。选用MS为基本的培养基,以叶片为外植体,建立了几种欧美杨品种的再生体系。再生培养基为:中林46杨:MS + 0.8mg/L BA + 0.08mg/L NAA;半常绿杨:MS + 0.8mg/L BA + 0.08mg/L NAA;108杨:MS + 1.0 mg/L BA + 0.05mg/L NAA。生根培养基:中林46杨MS +0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L IBA;半常绿杨1/2MS +0.02 mg/L NAA;108杨1/2MS +0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L IBA。同时,确定了几种杨树的卡那霉素选择压:半常绿杨和中林46杨的最适选择压为40mg/L,108杨最适选择压为35 mg/L。 3、杨树基因枪遗传转化体系的建立。以108杨叶片为受体,确定了杨树叶片基因枪转化的最佳转化参数。杨树叶片的最佳基因枪转化参数为:轰击距离9cm;氦气压1100psi;真空度25inchHg。而叶片是否经过渗透处理对转化效果没有影响。 4、杨树多基因共转化研究。对欧美杨108杨、中林46杨、半常绿杨以及银杨、银腺杨进行了多基因转化研究,获得了116个卡那霉素抗性植株,并进行了PCR检测。获得6个三基因(JEF36# 、Vgb、CryⅢ+Oc-Ⅰ)转化株系;58个双基因(JEF36# 、Vgb)转化株系;27个单基因(JEF36# 、Vgb)转化株系。


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