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杨树4CL基因调控木质素生物合成的研究

李金花  
【摘要】:木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物,林木中木质素占木材干重的15~36 %,木质素生物合成及调节在植物生长和发育中发挥重要作用,另一方面,木质素是制浆造纸业的不利因素,脱除纤维素中的木质素,需要消耗大量能源和使用有毒化学物质,提高了造纸成本并污染环境。近十几年来,人们对木质素生物合成也有了更多更深入的认识,随着木质素生物合成途径许多酶的编码基因被不断分离克隆出来,通过调控木质素生物合成途径中重要酶的编码基因的表达,抑制酶的活性,从而阻断木质素生物合成途径,降低木质素的合成量或单体组成,已经在一些转基因植株上取得了成功。因此,利用生物技术手段降低木质素含量或改变其制浆性能,创造出符合制浆造纸原料特性要求的林木品种,对于降低制浆造纸的经济成本和环境保护等方面都具有重要意义。 4CL 是木质素生物合成途径的核心酶之一,在木质素生物合成途径中处于终端位置。加拿大UBC 大学Douglas 小组获得了杨树4CL 酶的编码基因Ptd4CL3 的全长cDNA 片段,该基因与木质素生物合成有关,其重组蛋白具有4CL 酶活性,且在木质部中特异性表达。为了探讨Ptd4CL3 基因在木质素生物合成的作用及其在基因工程育种中的应用前景,本文以我国杨树工业用材林优良品种为试材,利用Ptd4CL3 基因cDNA 开展了基因工程下游研究工作,取得了一些研究结果。 1. 利用双元载体pBIN19/RT101,将Ptd4CL3 基因的全长cDNA 片段1.6 kb,分别反向和正向插入双元载体CaMV 35S 启动子之后,构建了该基因的反义和正义表达载体pBIN19/RT101-AS4CL 和pBIN19/RT101-S4CL,并成功地转入了根癌农杆菌GV3101 中。 2. 以白杨派杂种717 杨为参照,选择我国杨树工业用材林主栽优良品种107杨、108 杨、111 杨、110 杨和109 杨(黑杨派或派间杂种无性系)5 个品种为试材,对其叶片再生体系进行了优化,建立了高效的叶盘法农杆菌遗传转化程序,并获得了经抗Kan 生根筛选的正义和反义4CL 基因结构的转基因植株。 3. 利用PCR 检测初步筛选出了批量转基因植株,对温室培养10 个月的717杨和110 杨的转基因植株进行4CL 酶活性和Klason 木质素分析,与对照植株相比,转基因植株木质部中4CL 酶活性降低了10 %~50 %,木质素含量降低10 %~40 %,且转基因植株的形态和生长发育未见异常。结果表明,利用反义RNA技术抑制4CL基因表达,能有效降低转基因植物4CL 酶活性和木质素含量,并且正义和反义4CL基因机构的转化均引起了木质素含量减低,已经筛选出了木质素含量下降10%以上的717杨和110杨的转基因株系。利用717杨转基因植株和对照植株进行RT-PCR


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