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河北杨巯基蛋白酶抑制剂基因的分离和功能鉴定

刘会香  
【摘要】:基因控制技术是森林有害生物综合治理(IPM)控制策略的核心技术之一,发现具有自主知识产权的功能基因是实现这一技术的关键和基础,巯基蛋白酶抑制剂(Cysteine proteinase inhibtor,CPI)是一类广泛存在于动植物和微生物体内的一个超级族,由于CPI能够有效地抑制昆虫中肠的巯基蛋白酶的水解作用而达到杀虫的目的,因此,巯基蛋白酶抑制剂已被广泛地应用于抗虫基因工程中。天牛类害虫作为我国林业上重大的森林有害生物,危害极其严重。天牛属于鞘翅目害虫,主要利用消化道内的巯基蛋白酶来进行消化,所以分离和克隆植物巯基蛋白酶抑制剂(Phytocystatins,PhyCys)基因并将其应用到天牛的抗虫基因工程中,将是一种有效的控制天牛措施。本研究选用我国抗天牛的乡土树种河北杨为研究对象,首次应用RT-PCR方法从河北杨形成层中分离和克隆了CPI基因,通过真核表达载体的构建和诱导表达,获得了经亲和层析和Western方法检测的真核表达重组蛋白,在此基础上对该基因进行了抗虫性的功能鉴定,主要研究结果如下: 1.应用RT-PCR技术从河北杨形成层中分离和克隆了CPI cDNA编码区段。序列分析表明该基因编码区长为710bp,包括一个429bp完整的开放阅读框,编码143个氨基酸残基,此序列具有典型的植物巯基蛋白酶抑制剂的保守序列。在此基础上,为获得更长的CPI cDNA,本研究应用了RT-PCR的方法获得了759bp的3'端河北杨CPI cDNA。 2.分析和预测了河北杨CPI cDNA基因所编码的蛋白质的相关特性。表明河北杨CPI是一种酸性(pI 6.51)的小分子量的多肽(15-20KDa);亲/疏水性、蛋白质活性位点和保守区段、亚细胞定位、跨膜区域和结构功能域分析表明:该基因所编码的蛋白具有一个疏水性区域和信号肽区域(MISSSF ISPLLTLAVVLTVTI TPLISA),具有典型的cystatins保守区段和蛋白质活性位点(EQVVAGTMHHLTIE),属于一种细胞外蛋白并具有一个跨膜区域(LLTLAVVLAVTITPLISASGGFC),蛋白结构功能域分析表明,河北杨CPI也属于一种单结构域(GGVHDSQSSQ NSAEIDSLA RFAV)的小分子多肽。 3.应用PCR方法获得了795bp的河北杨CPI基因,其基因中包含一个内含子和两个外显子,具有典型的GT/AG法则。其启动子序列从上游第4个碱基-到第54个碱基,是一种来自于林木上的单结构域的植物CPI,不能归于Margis所进行的分类范畴,属于一种新的植物CPI。 4.应用CLUSTAL(1.83)软件比对了河北杨与其它43种植物CPI的氨基酸序列同源性,结果表明,河北杨和大多数植物CPI具有相同的保守区域,说明了河北杨CPI在进化上比较保守;应用MEGA3.1对上述植物CPI的系统发育分析表明,植物CPI可


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