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美国白蛾核型多角体病毒及其感病寄主检测方法的研究

乔鲁芹  
【摘要】: 从多方面研究了美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HcNPV)。内容包括:HcNPV形态特征、美国白蛾幼虫的感染HcNPV的病理过程、美国白蛾幼虫对病毒的敏感性、病毒对寄生性天敌昆虫白蛾周氏啮小蜂的影响、建立了荧光定量PCR和ELISA分析技术检测核型多角体病毒的方法,并对病毒在幼虫体内增殖动态进行了定量检测。主要研究内容和取得的结果如下: 1、利用电子显微镜进行观察,发现美国白蛾核型多角体具有多种形态:有的为三角形、四角形、也有五角型、六角型的,直径大小为0.8~2μm;为多粒子包埋型,囊膜大小为0.4~0.6μm×0.57~1.11μm;囊膜内病毒粒子的数目一般4-12个。 2、测定了美国白蛾2~5龄幼虫对HcNPV的敏感性。2龄幼虫对HcNPV敏感性最高,5龄幼虫对病毒敏感性最低。幼虫感染病毒后,其半数致死浓度LC_(50)值随着幼虫龄期的增加而增大;3龄、4龄和5龄幼虫的LC_(50)值分别是2龄幼虫的14倍、105倍和3500倍。以每毫克幼虫体重半数致死中浓度(毫克体重的LC_(50)值)作为衡量幼虫对病毒敏感程度的指标,则2龄幼虫对病毒的敏感性分别是3龄、4龄和5龄幼虫的3.3倍、4.5倍和59.7倍。在相同龄期内,幼虫感染病毒后半数死亡时间随感染剂量的下降而升高。2龄幼虫在感染剂量为5.3×10~5 PIBs/mL、5.3×10~4 PIBs/mL、5.3×10~3 PIBs/mL时,LT_(50)值分别为4.6天、6天、8.8天;5龄幼虫在感染剂量为5.3×10~8 PIBs/mL、5.3×10~7 PIBs/mL时,LT_(50)值分别为12天、14.2天;而在相同剂量下,半数死亡时间随着龄期的增加而增加。在感染剂量为5.3×10~5 PIBs/mL时,2龄、3龄、4龄幼虫的LT_(50)值分别为4.6天、11.1天、14.7天,5龄幼虫在此剂量下,死亡率只有15%。结论为:美国白蛾幼虫对其HcNPV的敏感性不仅与幼虫体重相关,而且与龄期相关。 3、美国白蛾幼虫在接毒后,不同组织细胞随时间推延而发生一系列的病理变化。在感染病毒后48h,观察到中肠细胞核内产生浅色的环状带;在感染后120h,体壁真皮细胞发生异常分裂增生,出现双层细胞结构;在168h真皮细胞层出现3~4层细胞结构,这是HcNPV感染的特有症状;感染后216h,体内大部分组织解体,成熟的多角体充满体腔,幼虫濒于死亡。 4、根据美国白蛾核型多角体病毒的多角体蛋白基因Polyhedrin的保守序列,利用引物设计软件Beacon Designer 5.0设计了特异性引物。用SYBR Green荧光染料法构建了标准曲线y=-3.450x+36.154,检测灵敏度为10~1~10~2copies/μL。建立了快速检测美国白蛾核型多角体病毒的方法。 5、通过已建立的荧光定量PCR检测HcNPV多角体蛋白基因Polyhedrin的方法,对感病幼虫的中肠、血淋巴及整个虫体进行了检测。发现中肠细胞在感病后12~108h内,每毫克肠重的Polyhedrin基因拷贝数在10~4~10~5copies范围内波动,在此范围内并没有呈现出明显的增高或降低的趋势;血淋巴样本Polyhedrin拷贝数在3~108h内呈现增长趋势,但范围保持在10~4 copies/μL之内。幼虫样本每毫克体重Polyhedrin拷贝数对数值与感染时间(h)对数值呈直线相关,回归方程式为:y=3.901x±1.094(R=0.966,P<0.01)。 6、建立了间接ELISA检测样品中的美国白蛾核型多角体的方法,确定兔抗美国白蛾核型多角体病毒最佳抗血清蛋白的含量为53.65μg/mL,美国白蛾病毒液抗原最佳浓度为10~7PIBs/mL,最佳封闭条件为0.5%BSA+2%蔗糖封闭37℃水浴2h、4℃24h。美国白蛾病毒抗原的最小检出量为0.304μg/mL,即1.77×10~4PIBs/mL。 7、美国白蛾核型多角体病毒浓度在3.12×10~5~1.0×10~7PIBs/mL范围内其对数值与吸光度OD_(490)呈线性关系;在死亡前两天幼虫体内多角体达到平台期。 8、选取了包括HcNPV在内的目前我国利用药剂防治美国白蛾中有代表性的几种,模拟林间施药方式,研究了它们对美国白蛾的重要寄生性天敌—白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea Yang成蜂安全性。同时研究了HcNPV对白蛾周氏啮小蜂繁殖的影响。结果表明:化学农药对白蛾周氏啮小蜂成蜂的寿命有显著影响;仿生农药和生物杀虫剂对成蜂寿命没有显著影响;而核型多角体病毒对小蜂繁殖没有显著影响。以上研究结果表明在美国白蛾幼虫期使用HcNPV病毒、蛹期放蜂的综合治理美国白蛾的技术是科学而可行的。


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