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毛竹SSR位点引物开发及部分竹种系统学分析

刘贯水  
【摘要】: 竹类植物是禾本科一个最大的自然类群,具有70余属,1200余种。竹子不仅具有生长快,用途广等特性,而且还具有良好的水源涵养和水土保持等环境功能。竹类植物通常难以开花,而且一旦开花,植株乃至全林即全部枯死,因而传统的以花、果实形态为主的分类方法对竹类植物十分困难。目前竹子的分类依然存在着很多争议,而分子标记技术的应用为竹子系统分类的深入开展提供了新的依据。SSR(Simple Sequence Repeat)简单序列重复,又称为微卫星,这类分子标记具有含量丰富,多态程度高,检测方法简便,不受环境和基因表达影响等特点,在种质鉴定、遗传多样性分析以及系谱分析中成为一种理想的分子标记。目前,竹类植物的微卫星引物开发国内外报道较少,无法满足竹子系统研究的需要。 本研究通过磁珠富集法开发了31对毛竹SSR引物并对部分竹类植物进行了系统分类学研究。主要结果如下: 1通过磁珠富集,成功构建了毛竹基因组DNA的GT、AG、CCA重复序列的富集文库,利用克隆PCR方法共检测了2330个克隆,三个文库分别检测菌落数为1080、620、630个,阳性克隆分别为219、113、119个,阳性率为19.4% (451/2330); 2获得350条非冗余序列,长度范围在61~831bp之间,平均为288bp,序列总长为100 704bp,占毛竹基因组大小约1/20000;发现重复位点641个,重复次数在3~54次之间,其中重复3、4、5、6、7、8、9、10、10次的位点数分别为415、86、37、14、19、8、12、11、39个;双核苷酸重复位点最多,为521个,三核苷酸、四核苷酸位点数分别为108、35个; 3对获得序列进行Blast比对,结果显示:所得序列与GenBank登录序列的毛竹基因序列相似数最多,为63条,与水稻、甜高粱、小麦、玉米序列相似数分别为28、11、3、3条,这与毛竹的基因组进化地位相吻合; 4设计合成了53对SSR引物,以毛竹基因组DNA为模板对这些引物是否工作进行了检测,其中34对引物扩增出了预期大小的条带,利用温度梯度PCR确定了各引物最适退火温度; 5用荧光标记物FAM对34对引物中的正向引物进行标记,利用毛细管电泳分析9份毛竹种内样品SSR-PCR扩增产物的大小,其中引物对27、36、40的扩增产物中具有非预期大小的片段,对这三对引物扩增黄槽毛竹的PCR产物进行了克隆和序列分析,发现这些位点存在序列重复;利用其余31个位点对9份毛竹种内样品进行位点特征分析,发现31个位点在除黄槽毛竹的8个毛竹样品中都有预期大小的等位基因的扩增,而黄槽毛竹的位点特征与其他8个毛竹样品具有较大差异,其中位点2、17、38、42、50对黄槽毛竹显示零等位,位点8、13、15、18、21、24、28、31、32、33、37、41、43、46、49、51具有不同于其他8个毛竹样品的特殊等位基因,这些差异位点占总位点数的61.8% (5+16/34); 6对除黄槽毛竹的8份毛竹样品的31个SSR位点进行分析,结果显示:有18个位点在所有8份毛竹样品中都只扩增出了一个大小相同的片段,其余13个位点的扩增条带具有差异,表现出了多态性;这31个位点的等位基因数(Observed Number of Alleles, Na)在1~3个之间,平均为1.548个;有效等位基因数(Effective Number of Alleles, Ne)在1~2.65之间,平均有效等位基因数为1.375个;这些位点的观测杂合度(Observed Heterozygosities, Ho)在0~1之间,平均为0.309;期望杂合度(Expeeted Heterozygosities,He)在0~0.67之间,平均为0.201;多态信息含量在0~0.575之间,平均为0.147;13个多态位点中只有1个位点的多态信息含量在0.5以上,其余12个位点在0.110~0.48之间,平均为0.352,多态信息含量较低,这些都表明毛竹种内遗传差异较小,基因突变程度较低; 7对唐竹属、业平竹属、大节竹属的11个竹种的31个SSR位点进行了分析,检测结果用NTsys软件计算竹种间的Nei氏遗传距离(Nei's Distance),非加权算数平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)对遗传距离矩阵进行聚类分析,结果显示31个SSR位点可以将这11个竹种分为三个属区; 8对刚竹属内51份样品的31个SSR位点进行了分析,聚类结果表明:符合传统分类学方法,说明这些SSR位点可以为刚竹属植物属内的分类提供参考;各竹种种下等级之间的遗传距离大于零,说明它们相互间存在着一定的遗传变异,个体间具有遗传多样性,表明这些SSR位点可以对种内个体的进行遗传多样性及聚类研究,而且利用这些引物也可以开发为竹种或杂交种分子鉴定的标记;结果还显示竹种的种内变异程度小于种间变异,表明这些SSR位点可以为刚竹属的存在争议的种的界定提供参考。


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