收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

小鼠神经行为测试组合建立及邻苯二甲酸二异丁酯对小鼠学习记忆影响的研究

马宁  
【摘要】:目的: 建立啮齿类动物感觉-运动和学习-记忆神经行为测试组合。应用所建立的学习-记忆行为测试组合研究邻苯二甲酸二异丁酯(DiBP)亚慢性经口染毒对小鼠学习记忆能力的影响,并初步探索其可能的毒性机理。为评价邻苯二甲酸类化合物作为增塑剂用于包装材料的风险提供科学依据。 方法: 1神经行为毒理学测试组合建立 1.1感觉-运动行为测试组合 1.1.1试验设计 C57BL/6雄性小鼠适应性饲养7d后,以热板试验小鼠添后足的潜伏时间随机分组,设一个对照组和4个丙烯酰胺剂量组,每组15只。染毒剂量分别为5mg/kg bw、10mg/kg bw、20mg/kg bw、30mg/kg bw,每周5次,连续8周,对照组灌胃给予蒸馏水,普通饲料喂饲,自由饮水。前三周每周对各项神经行为指标测量1次,8周喂养试验结束后再测量1次神经行为指标。 1.1.2感觉-运动行为学测试方法选择 选择伤害性知觉测试、平衡能力测试、抓力测试、运动神经能力测试、自主活动能力测试作为感觉-运动行为测试组合。以上所有试验测试3次,每次间隔30分钟,取平均值。 1.2学习-记忆行为测试组合 1.2.1试验设计 216只雄性昆明小鼠,实验动物房内适应3天,随机分为6组,每组36只,即空白对照组(玉米油)、4个邻苯二甲酸二异丁酯剂量组(50、250、500、1000mg/kg bw)和阳性对照组(氢溴酸东莨菪碱)。对照组给予玉米油溶剂灌胃,各剂量组给予相应剂量的邻苯二甲酸二异丁酯玉米油溶液灌胃,连续8周,每周称重2次。阳性对照组在行为测试前10分钟腹腔注射氢溴酸东莨菪碱5mg/kgbw。染毒前后,分别对小鼠进行学习记忆相关的行为学检测。 1.2.2学习记忆行为学测试方法选择 选择旷场试验、Morris水迷宫试验、避暗箱试验和穿梭箱试验,作为学习记忆行为测试组合。 2邻苯二甲酸二异丁酯对小鼠学习记忆功能的影响及其信号转导机制研究 2.1动物选择和染毒方式 120只雄性昆明小鼠,实验动物房内适应3天,随机分为5组,每组24只,即空白对照组(玉米油)、4个邻苯二甲酸二异丁酯剂量组(50、250、500、1000mg/kg bw)。对照组给予玉米油溶剂灌胃,各剂量组给予相应剂量的邻苯二甲酸二异丁酯玉米油溶液灌胃,连续8周,每周称重2次。 2.2学习记忆行为学检测 DiBP染毒后,分别对小鼠进行学习记忆相关的行为学检测,包括旷场试验、Morris水迷宫试验、避暗箱试验和穿梭箱试验,通过上述实验检测小鼠的自主活动能力、空间参考记忆、被动回避和主动回避能力,观察DiBP对小鼠学习记忆能力的影响及判断造模是否成功。 2.3脑组织中DiBP含量的测定 行为学实验结束后,各组随即抽取6只小鼠托颈椎处死后取其脑组织用于检测,通过应用液相色谱法测定脑组织中DiBP的含量,观察其是否可通过血脑屏障。 2.4小鼠海马神经细胞的形态学检测 2.4.1光学显微镜标本制备 行为学测试结束后,每组随机选取6只小鼠,用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸经左心室插管,先快速灌注预冷的生理盐水直至流出液变清亮、继以4%的多聚甲醛在30分钟内持续灌注,充分固定后,在冰上快速分离海马,取出的海马在4%甲醛中继续固定2h,然后脱水透明后进行石蜡包埋和切片。 2.4.2 HE染色光镜观察 将切片进行HE染色后,光镜下观察海马组织的形态结构。 2.4.3 Nissl小体计数 每只小鼠取3张切片,进行Nissl染色。光镜下对海马CA1、CA2和DG区Nissl染色阳性的细胞进行计数,每张切片取连续的3个视野,3张切片的平均值为该样本的阳性细胞数。 2.4.4透射电子显微镜观察 小鼠灌注预冷的生理盐水及4%的多聚甲醛后,在冰上快速分离海马,切取1mm×1mm×1 mm海马CA3区组织块进行超薄切片,并在透射电子显微镜下观察,照相。 2.5神经毡内突触计数 在电镜下每个标本随机选取10处神经毡,统一放大至15000倍拍片,计数突触数量并作统计学分析。 2.6细胞凋亡率检测 制备海马神经细胞悬液,按照凯基Annexin V-FITC PI凋亡检测试剂盒说明书操作进行流式细胞仪检测。 2.7小鼠抗氧化酶活性及DNA损伤测定 行为学实验结束后,拔眼球取血分离淋巴细胞,进行彗星实验;取肝脏组织,测定肝脏组织超氧化岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性及丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量;取脑组织测定组织超氧化岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。 2.8小鼠脑组织中氨基酸类神经递质测定 采用液-质联用检测法测定。 2.9海马组织中cAMP含量测定 制备组织匀浆后,采用酶联免疫法测定 2.10突触可塑性相关蛋白:NMDAR1蛋白、PSD95蛋白、磷酸化蛋白激酶A(P-PKA)、磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白(P-CREB)、磷酸化钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(P-CamkⅡ)、脑源性神经营养因子受体(TrkB)蛋白的测定 应用蛋白印迹法(Western blot)和免疫组化法测定。 2.11海马CREB、BDNF、CaMKⅡ、c-fos和c-jun等相关基因的测定 应用Real Time PCR法检测 结果: 1神经行为毒理学测试组合建立 1.1感觉-运动行为测试组合建立 1.1.1在整个试验过程中,给予丙烯酰胺的各剂量组无一只动物死亡,各剂量组小鼠的体重与对照组相比无明显变化。通过临床观察未发现各剂量组动物出现躁动、激惹、甚至步态摇摆不稳等临床症状。 1.1.2染毒前各组小鼠各项行为学检测结果无明显差异,表明各组小鼠的感觉-运动能力在染毒前处于同一水平。丙烯酰胺染毒结束后,小鼠伤害性知觉、平衡能力、抓力、后肢支撑力均出现了一定的损伤,与以往研究结果相似。 1.2学习记忆行为测试组合建立 1.2.1在整个试验过程中无动物死亡,各组小鼠体重在喂养期间及喂养结束时与对照组相比无明显变化。 1.2.2染毒前各组小鼠行为学检测无明显差异,各组小鼠的学习记忆能力在染毒前处于同一水平。 1.2.3阳性物(氢溴酸东莨菪碱)和DiBP均可使昆明小鼠空间参考记忆、被动回避和主动回避能力减退,但对小鼠的自主活动能力影响不明显。 2邻苯二甲酸二异丁酯对小鼠学习记忆功能的影响及其信号转导机制研究 2.1在整个试验过程中,给予DiBP的各剂量组动物无死亡,各剂量组小鼠的体重在喂养期间及喂养结束时与对照组相比无明显变化。 2.2空白对照组、50mg/kg bw和250mg/kg bw剂量组的小鼠脑组织中均未检测到DiBP。500mg/kg bw和1000mg/kg bw剂量组小鼠脑组织中均存在一定水平的DiBP,且1000mg/kg bw剂量组的DiBP含量要显著高于500mg/kg bw剂量组。 2.3DiBP可使昆明小鼠空间参考记忆、被动回避和主动回避能力减退,但对小鼠的活动能力影响不明显。 2.4HE染色结果显示,250mg/kg组3例、500mg/kg组3例、1000mg/kg组2例组织可见海马锥体细胞层数减少,排列稀疏、不规则,细胞体积变小,核固缩现象明显。Nissl染色结果显示,空白对照组椎体细胞排列整齐、密集,尼氏体含量丰富。1000mg/kg bw剂量组细胞排列松散,小鼠海马CA1、CA3和DG区域单位面积的细胞数量较空白对照组少,并且有统计学差异(P0.05)。其它各剂量组细胞排列较为整齐,细胞层数无明显减少,尼氏体清晰,各区域尼氏小体数量与空白对照组相比无统计学差异。透射电镜下观察可见,对照组小鼠海马CA3区神经元胞浆和胞核染色质分布均匀,细胞核形态规则,核膜光滑,细胞器丰富。但各剂量组小鼠海马CA3区神经元的超微结构发生了不同程度的病理改变,且以500mg/kgbw和1000mg/kg bw剂量组最甚。 2.5随着染毒剂量的增高,各剂量组小鼠海马CA3区神经毡内突触数量逐渐减少,且500mg/kg bw和1000mg/kg bw剂量组突触数量与空白对照组相比减少明显,有统计学差异(P0.01)。 2.6随着DiBP染毒剂量增高小鼠海马神经细胞凋亡率有升高的趋势,1000mg/kgbw剂量组和空白对照组相比有统计学差异(P0.05)。 2.7小鼠抗氧化酶活性及DNA损伤研究结果显示,各剂量组小鼠肝脏组织中的SOD和GSH-PX活性降低,MDA和8-OHdG含量增加。250mg/kg和1000mg/kg剂量组脑组织中GSH-PX活性降低,各剂量组脑组织中8-OHdG含量增加。对照组小鼠淋巴细胞DNA基本呈圆形,无拖尾出现,各染毒剂量组小鼠淋巴细胞DNA则出现不同程度拖尾现象。 2.8DiBP对兴奋性氨基酸(GLU、ASP)无影响,而抑制性氨基酸(GABA)含量,随着DiBP染毒剂量的增加有下降趋势,且1000mg/kg bw剂量组与对照组相比有显著性差异。 2.9随着DiBP染毒剂量的增加小鼠海马组织cAMP含量有降低的趋势,1000mg/kg bw剂量组与对照组相比差异也具有统计学意义(P0.05)。 2.10各DiBP剂量组小鼠海马PSD95、NMD AR1、p-CAMKⅡ、p-PKAC和p-CREB蛋白表达水平与对照组相比均有所下调,并且随着剂量的增加这种改变越明显。 2.11DiBP可通过cAMP/PKA-CREB信号通路下调CREB、BDNF、CaMKⅡ、c-fos和c-jun等基因的表达。 结论: 1.感觉-运动行为试验组合(热板试验、转棒试验、抓力试验、后肢支撑力试验、自主活动能力试验)和学习-记忆行为试验组合(旷场试验、Morris水迷宫试验、避暗箱试验和穿梭箱试验)可针对化学毒物的感觉-运动毒性和学习-记忆毒性进行筛查,提供敏感的毒性识别指标。 2.首次利用学习-记忆行为毒性研究,证实DiBP可使小鼠学习记忆能力受损。首次证实DiBP经口摄入后可通过血脑屏障进入脑组织,并使海马组织发生形态学改变。 3.首次发现亚慢性暴露DiBP可导致小鼠海马cAMP-PKA信号通路中主要信号分子发生异常改变,使CREB磷酸化水平下降,CREB下游基因的表达水平下降,这可能是DiBP致学习记忆功能损伤的重要分子机制。 4.研究证实DiBP可使小鼠抗氧化防御系统功能降低,并导致DNA损伤。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 赵月朝,姚崇林,陈亚妍;气相色谱法测定水源水中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[J];中国公共卫生;1997年11期
2 侯中林,姜艳香,许小平;邻苯二甲酸二辛酯对大鼠睾丸、附睾及精子损伤的时间效应[J];卫生毒理学杂志;1993年02期
3 王立生,吴祖泽,裴雪涛,徐黎,曹菊荣,贺福初;邻苯二甲酸正丁酯诱导白血病细胞系HL-60、U937细胞程序性死亡[J];中华血液学杂志;1995年12期
4 陈理;空气中邻苯二甲酸二辛酯气相色谱分析的研究[J];中国卫生检验杂志;1998年01期
5 陈剑刚;白艳玲;谭爱军;;空气中酞酸酯化合物的毛细管气相色谱测定法[J];中华劳动卫生职业病杂志;2006年01期
6 侯中林,许小平;邻苯二甲酸二辛酯对雄性大鼠的生殖毒性[J];卫生毒理学杂志;1992年02期
7 王簃兰;参加国际邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯会议概况[J];中国职业医学;1992年03期
8 许浩,郭家胤,梁卫玖;饮用水中邻苯二甲酸二-2-乙基已酯的测定[J];上海预防医学杂志;2005年07期
9 ;卫生部办公厅关于对邻苯二甲酸酯类物质安全评价情况的复函[J];中国食品卫生杂志;2007年06期
10 侯中林,江泉观;邻苯二甲酸酯类化合物的雄性生殖毒性[J];卫生毒理学杂志;1992年03期
11 郑力行,诸建辉,张蕴辉,陈秉衡;精液中三种邻苯二甲酸酯类物质的测定[J];中国卫生检验杂志;2002年05期
12 方萍;罗善云;梁浩麟;雷森林;;电镜包埋剂邻苯二甲酸二丙烯酯与环氧树酯~#618的比较观察[J];解剖学杂志;1989年04期
13 胡晓宇,张克荣,孙俊红,吴德生;中国环境中邻苯二甲酸酯类化合物污染的研究[J];中国卫生检验杂志;2003年01期
14 陈理,寿越穗;空气中邻苯二甲酸二辛酯气相色谱分析的应用[J];浙江预防医学;1997年06期
15 马建红,吕立夏,厉曙光;邻苯二甲酸二酯诱导果蝇脑组织基因差异表达谱的研究[J];环境与职业医学;2005年02期
16 吴平谷,韩关根,王惠华,赵莹;饮用水中邻苯二甲酸酯类的调查[J];环境与健康杂志;1999年06期
17 李正;哈佛大学研究发现DEP对DNA有害[J];精细与专用化学品;2003年08期
18 侯中林;许小平;段成炬;王化潮;李雅芳;姜艳香;于玲玲;郭佳忠;;邻苯二甲酸二-2-乙基己酯对雄性大鼠生殖毒性的时间效应[J];化工劳动保护.工业卫生与职业病分册;1992年05期
19 王立生,吴祖泽,裴雪涛,徐黎,曹菊荣;邻苯二甲酸正丁酯体外净化白血病细胞的实验研究[J];中华器官移植杂志;1995年02期
20 王蕊,李厚勇,郭启明,刘永霞,陶玉珍;邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯的遗传毒性[J];卫生毒理学杂志;2001年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙文秀;徐怡庄;郭凡修;刘学新;杨展澜;陶栋梁;吴瑾光;徐端夫;;纳米邻苯二甲酸铽在聚苯乙烯膜中的荧光特性研究[A];第九届全国发光学术会议摘要集[C];2001年
2 马翠芳;;用高效液相色谱法同时测定顺酐废水中的有机酸及酯[A];西北地区第六届色谱学术报告会甘肃省第十一届色谱年会论文集[C];2010年
3 丁瑜;高宇;施蓉;周义军;田英;;邻苯二甲酸(2-乙基已基)宫内暴露对雌性子鼠性发育影响[A];持久性有机污染物论坛2009暨第四届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2009年
4 程文婷;袁先艳;任保增;;邻苯二甲酸的溶解度测定及关联[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
5 张绮;王克波;敖淑清;王惠娟;;饮用水中内分泌干扰物及其危害[A];江苏省性学会第六次学术会议论文集[C];2006年
6 王喜贵;吴红英;赵斯琴;赵慧;;铕-镧混配邻苯二甲酸-1,10-菲咯啉配合物的合成及发光性质[A];第十四届全国分子光谱学术会议论文集[C];2006年
7 刘晓茹;刘玲花;高继军;童宝锋;任学蓉;;GC-MS法测定酞酸酯实验中干扰因素分析[A];2005年全国有机质谱学术交流会论文集[C];2005年
8 华燚;魏光辉;李旭良;林涛;何大维;刘俊宏;刘丰;陆鹏;;邻苯二甲酸二(2—乙基己基)酯DEHP对雄性大鼠生精功能影响[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
9 褚大鹏;夏红飞;马旭;;邻苯二甲酸单丁酯对早期胚胎毒性机制[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
10 郝向英;赵慧;昭日格图;;邻氰基苯甲酰胺合镧的合成与表征[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(上册)[C];1999年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 鲁英;乌鲁木齐市生活饮用水中有机物现状及其类雌激素效应的研究[D];新疆医科大学;2010年
2 褚大鹏;邻苯二甲酸酯对小鼠植入前胚胎体外发育的影响及作用机制的研究[D];北京协和医学院;2013年
3 张蕴晖;邻苯二甲酸酯类的雄性生殖发育毒性及健康危险度评价[D];复旦大学;2004年
4 封少龙;应用蚕豆根尖微核技术研究混合污染物及土壤、沉积物和垃圾焚烧灰的遗传毒性[D];中国科学院研究生院(广州地球化学研究所);2004年
5 鲁翌;邻苯二甲酸酯类化合物好氧生物降解的实验研究[D];华中科技大学;2009年
6 范明明;光敏热显成像材料热显影过程中影响银离子迁移因素的模拟研究[D];天津大学;2008年
7 路瑶;稻壳和麦秆及其萃余物的逐级氧化[D];中国矿业大学;2013年
8 张凤秀;润滑油类羧酸酯的绿色合成、光降解特性及其对土壤生态的影响[D];西南大学;2009年
9 韩雪;重庆及三峡库区多环芳烃和邻苯二甲酸酯类物质环境暴露对男性生殖器损害的研究[D];第三军医大学;2011年
10 陈曦;P53非依赖性信号通路在邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯致体外培养人肝细胞毒性中的调控作用[D];华中科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郭林;邻苯二甲酸的溶解度测定及其神经网络模拟[D];郑州大学;2005年
2 齐学兵;齐墩果酸邻苯二甲酸单酯的合成工艺优化及其保肝作用的研究[D];黑龙江中医药大学;2001年
3 辛晓晶;可环境消纳塑料助剂——共生稀土(镧、铈、镨)-邻苯二甲酸配合物的合成、表征及光敏化效果研究[D];福建师范大学;2004年
4 吴朝华;气相色谱法测定饮料中邻苯二甲酸酯类的研究[D];南京理工大学;2011年
5 王粟明;食品中邻苯二甲酸酯类化合物的新分析方法研究[D];复旦大学;2011年
6 赵琳;气相色谱—质谱联用技术测定食品中邻苯二甲酸酯类的研究[D];河南大学;2013年
7 陶然;食品中邻苯二甲酸酯类化合物残留分析方法的研究[D];安徽工程大学;2013年
8 马丽;塑料包装白酒中增塑剂迁移行为的研究[D];山西大学;2013年
9 张娜;邻苯二甲酸酯类化合物的生态毒性评价[D];辽宁师范大学;2010年
10 陈济安;邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯降解菌的分离及其降解功能研究[D];第三军医大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 邱爽;我国玩具因增塑剂超标遭通报[N];保健时报;2010年
2 安济士(Christopher Angius);CPSC推迟执行儿童产品含铅和邻苯二甲酸的检验要求[N];中国贸易报;2009年
3 苏志明;欧盟严禁儿童用品中的邻苯二甲酸盐含量[N];中国质量报;2006年
4 戴炳仁;关注欧盟邻苯二甲酸盐新标准[N];中国国门时报;2006年
5 苏志明;欧盟在玩具中限制邻苯二甲酸盐含量指令生效[N];中国国门时报;2007年
6 本报记者  张丽娜;问题T恤可影响生殖发育[N];消费日报;2006年
7 南方;我国玩具业亟须“遵规守矩”[N];经理日报;2006年
8 刘加莹;香水中的有害物质该不该在意[N];中国商报;2002年
9 记者 高照;车内空气污染浓度是室内的10倍[N];中国石油报;2006年
10 孟晶;吉力士新一代TPE亮相橡塑展[N];中国化工报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978