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中国大肠杆菌O157:H7暴发相关菌株的遗传学和毒力分析

王娉  
【摘要】:肠出血性大肠杆菌(Enterohermorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157:H7是出血性肠炎(Hemorrhagic colitis, HC)、血小板减少性紫癜(Thrombotic thrombocytopenia purpura, TTP)和溶血性尿毒综合症(Hemolytic uremic syndrome, HUS)的病原体,1982年被发现以来,世界许多国家和地区都有不同规模的暴发。1999年4-8月间,我国苏皖交界地区发生了大肠杆菌0157:H7感染的暴发,报告急性尿毒综合症患者195人,死亡177人,估计感染20000余人。这是迄今为止世界上发病人数最多、病死人数最多的一次大肠杆菌0157:H7暴发。但中国暴发相关菌株的分析一直未能解释流行病学和临床特点。 我们使用包括15个看家基因的多位点序列分型(Multi-Locus Sequencing Typing, MLST) (http://www.shigatox.net/mlst)方法,可以把124株中国分离菌株分成5个序列型(ST型):ST23包含101株菌,ST24包含3株菌,ST96包含16株菌,ST97包含3株菌,ST98只有1株菌。其中,ST96-97是新发现的ST型。1999年暴发期间所有从患者分离的5株菌都属于ST96。ST96还包括6株1999年暴发地区从家畜家禽中分离的菌株,1株1992年从山东省患者分离的菌株,4株2001年从云南食品中分离的菌株。有趣的是,2001年以后,我国未能继续分离到ST96型别的菌株。 为了进一步了解我国1999年暴发相关菌株的特点,我们对中国分离的124株菌和13株国外菌株进行了聚类分析。E-burst分析表明,大肠杆菌055序列群以ST26为founder,大肠杆菌0157序列群以ST23 (Sakai菌株)为founder,中国1999年暴发相关菌株Xuzhou21(ST96)与菌株Sakai有两个等位基因的差异,ST97型别的菌株与Sakai有一个等位基因的差异,ST96型别的菌株与ST97型别的菌株有一个等位基因的差异,ST98型别的菌株与Sakai也存在一个等位基因的差异。以数据库中11克隆群中的5个大肠杆菌055:H7菌株作为外群,用最大简约法(MP)构建系统发生树,新发现的3个ST型(ST96-98)与其余5个ST型别ST23, ST24, ST25, ST84,ST101形成了一个克隆群。研究发现,和1982年美国暴发相关菌株EDL933、1996年日本暴发相关菌株Sakai、以及2006年美国暴发相关菌株TW14359不同,1999年中国暴发相关菌株Xuzhou21和1996年日本暴发相关菌株遗传学关系较近,和1982年、2006年美国暴发相关菌株EDL933和TW14359遗传学关系较远。使用基因组序列构建的系统发生树和使用15个管家基因序列构建的系统发生树的结果基本一致。结果提示,在世界上引起2万人规模暴发的大肠杆菌0157:H7菌株Xuzhou21和Sakai在遗传学上密切相关。 那么,在遗传学上密切相关的暴发相关菌株Sakai和Xuzhou21是否在表现型上具有和其他菌株不同的特点呢?为此,我们对实验室保存的暴发相关菌株ELD933、Sakai和Xuzhou21进行了生物学特性的比较研究,包括酸抗性、产生志贺毒素2和刺激外周血单核细胞产生细胞因子的能力。我们发现,将菌株在pH3.0的酸性溶液中作用2小时后,Xuzhou21和Sakai的存活率分别为45.7%,46.7%,EDL933为23.6%。表明Xuzhou21和Sakai对酸的抗性相似。对酸抗性相关基因rpoS的测序分析发现,Sakai的rpoS序列与已发表的两株耐受性较强菌株AF182102和AF182107的rpoS序列完全相同。与Sakai比较,菌株EDL933有一个点突变(G917T),导致编码区内终止子的提前出现。菌株Xuzhou21有一个点突变(A904G),天冬氨酸变成了甘氨酸。对志贺毒素Stx2的表达水平研究发现,在未加入抗生素诱导的情况下,Sakai和Xuzhou21菌株的Stx2的mRNA表达水平分别是EDL933菌株的3.7倍和7.5倍;而加入丝裂霉素C(mitomycinC)诱导3小时后,Sakai、Xuzhou21菌株的Stx2的mRNA表达水平,分别是EDL933的32.7和68.6倍。将细菌灭活,与PBMC细胞共同孵育4小时后,发现EDL933、Sakai和刺激产生IL-1β的含量分别为207.45±11.08、234.84±±7.87、315.34±23.71pg/ml,刺激产生IL-6的含量分别为317.38±10.25、545.06±±33.69、565.31±22.09 pg/ml,产生IL-8的含量分别为2601.12±111.08、3568.51±123.97、4837.67±333.49 pg/ml。与EDL933相比,Xuzhou21和Sakai能够刺激PBMC产生较高水平的IL-1β、IL-6、IL-8,差别有统计学意义。 简言之,我们的研究发现,在1996年日本和1999年苏皖引起万人规模的大肠杆菌0157:H7暴发的菌株Sakai和Xuzhou21在遗传学上密切相关,可分为一个克隆群,它们也具有较高的酸抗性,产生高水平的志贺毒素2,能够刺激PBMC产生高水平的细胞因子IL-1B、IL-6、IL-8等。这些特性可能和它们能够引起大暴发有关。


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