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HIV-1假病毒耐药质控品的制备及评价

邓煜川  
【摘要】:HIV-1基因型耐药已广泛应用于我国艾滋病耐药监测与治疗后的耐药检测,为保证检测结果的准确性与可靠性,需要大量质控品用于室内质控与能力验证。目前,耐药质控品主要使用病人样品直接制备,存在潜在生物传染风险。同时,随着我国艾滋病抗病毒治疗工作的日益深化和规范,具有耐药位点的病人样品越来越难以获得,为解决这一难题,本研究首先对未经抗病毒治疗的HIV感染孕产妇的样本进行检测,筛选出具有耐药突变的样本,扩增POL区全长的目的基因片段,通过克隆制备HIV-1基因型耐药病毒样颗粒质控品,并对其均一性和稳定性进行评价,为艾滋病耐药检测实验室的室内质量控制和能力验证工作提供支持。第一部分耐药样本的筛选研究目的:通过对艾滋病高发省未经抗病毒治疗的HIV感染孕产妇感染毒株的基因亚型和耐药突变分析,筛选出具有耐药突变的样本。研究方法:收集2016年6月一2019年6月229例未接受抗病毒治疗的HIV感染孕产妇产时血样,提取HIV-1核糖核酸(RNA),通过巢式聚合酶链式反应扩增HIV蛋白酶区(PR)、反转录酶区(RT)并测序。构建进化树对HIV进行基因分型,新型重组毒株以simplot软件探索重组模式。使用斯坦福大学HIV耐药数据库在线工具分析耐药情况。研究结果:229例未经抗病毒治疗的HIV感染孕产妇血浆成功扩增197例,基因亚型为CRF07_BC 87例(44.16%)、CRF08_BC 56例(28.43%)、CRF01_AE 44例(22.34%)、未成功鉴定亚型9例(4.57%)以及CRF85_BC 1例(0.51%)。16例发生耐药,其中对NNRTIs耐药13例,对NRTIs耐药3例,对PIs耐药1例,并有1例是对NRTIs和NNRTIs的双重耐药。第二部分 含有HIV-1基因型耐药病毒样颗粒假病毒的构建研究目的:构建含有HIV POL区全长耐药基因的假病毒,为后续制备基因型耐药质控品做准备。研究方法:从第一部分耐药样本中选取1例包含最多耐药突变位点的双重耐药样本(编号为CDC3)。基因亚型为CRF07_BC,相关耐药突变位点为D67DN(NRTIs),K103KNRS、V106VIM(NNRTIs)、V35R、T39D、S48T、V60I、D121Y、K122E、W153W*、E169D、R211K、V245Q、E248N(Other)。耐药药物为 AZT、D4T(NRTIs),RPV、ETR、EFV、NVP、DOR(NNRTIs)。提取 RNA,通过巢式PCR扩增POL区全长基因并进行测序和耐药分析。用三种不同的克隆技术包装相应的重组质粒,即表达报告基因的重组慢病毒质粒、表达HIV Gag蛋白的质粒、表达HIV Rev基因的辅助质粒,并对其进行酶切和测序鉴定。将上述3种质粒和实验室留存的pVSVG包膜质粒及从耐药样本中扩增的POL全长目的基因片段共转染293T细胞,收集假病毒后检测其滴度。研究结果:耐药样本经PCR扩增得到测序结果,再提交斯坦福耐药数据库后得到的耐药结果与第一部分的结果一致。包装的3种重组质粒和表达包膜蛋白的质粒酶切和测序鉴定结果均显示质粒结构正确。四种质粒和POL目的基因片段共转染后有荧光信号,并且在收毒后测定的滴度为8.38×108TU/ml,显示假病毒构建成功。第三部分 HIV-1基因型耐药质控品均一性和稳定性的评估研究目的:用假病毒制备HIV-1基因型耐药质控品并对其均一性和稳定性进行评价。研究方法:用第二部分制备成功的假病毒加阴性血浆,制作成高、中、低浓度的质控品。并通过荧光定量PCR对质控品在不同放置时间、不同温度以及反复冻融后进行检测,将得到的Ct值进行统计学分析并评价质控品的均一性和稳定性。研究结果:均一性Ct值统计学结果差异无统计学显著性(P0.05),即均一性良好。稳定性结果显示质控品在37℃条件下可以保存1天、在室温下保存3天、在4℃下保存7天、在-20℃和-80℃条件下保存14天。5次反复冻融实验统计学结果显示差异无统计学显著性(P0.05)。研究结论:获得16例具有耐药位点及亚型背景信息的样本、成功构建1例含有HIV POL全长耐药基因片段的HIV-1假病毒,用假病毒制备的质控品具有良好的均一性和稳定性。


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