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乙型脑炎病毒全基因组分子进化及基因重组研究

潘晓玲  
【摘要】: 乙脑病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)为黄病毒科黄病毒属单股正链RNA病毒。病毒基因组全长约11kb,编码十余个结构与非结构蛋白。该病毒感染可以引起人畜共患传染病,临床称为乙脑,病死率高,存活者留有神经系统后遗症。全世界数十亿人群生活在乙脑流行区,乙脑病毒感染已经成为世界关注的公共卫生问题。本研究对乙脑病毒全基因组开展基因重组及分子进化研究,研究结果对于解释该病毒致病机理、病毒分子流行病学特征、病毒疫苗开发研究以及乙脑病毒的分子诊断等均有重要意义。 1.乙型脑炎病毒的全基因组序列的测定 本研究首先测定了121株我国分离的乙脑病毒全基因组核苷酸序列,毒株分离自我国20余种蚊虫标本、乙脑病例血清和脑脊液标本、以及蠓和蝙蝠标本;病毒分离时间自上世纪50年代至2007年;病毒分离地域覆盖我国乙脑主要疫区,北至我国黑龙江省,南至福建省,西至甘肃省,东至上海市。基因型包括基因Ⅲ型和基因Ⅰ型。测序质量分析统计显示:总平均覆盖率为7.41423927,平均质量值为40.34710744,即准确性值为99.99%,错误率为0.01%。接近于人类基因组计划测序质量标准,与相关研究中大规模病毒全基因组测定质量标准相当。 2.病毒数据库的建立 本研究利用MySQL语言和phpMyAdmin图形化管理界面创建了病毒基因信息数据库。该数据库收集了目前国际基因库(GenBank)公布的所有黄病毒科病毒基因与基因组序列信息,以及本研究所测定的121株乙脑病毒全基因组序列信息,共同构成了黄病毒科病毒核酸序列信息库(共含159,179条病毒序列信息)用于进一步分析研究。 3.乙型脑炎病毒全基因组重组研究 本研究利用12种基因重组分析软件对目前世界范围内178株乙脑病毒全基因组序列(57株乙脑病毒基因组序为GeneBank公布,121株乙脑病毒基因组序列为本研究测定)进行了乙脑病毒基因及基因组重组扫描(screen)。结果发现139株乙脑病毒存在大量基因型内和型间重组信号,占全部分析毒株78%(139/178)。基因Ⅱ型和基因Ⅳ型乙脑病毒无重组信号;通过生物信息学和统计学分析方法确定3株乙脑病毒发生基因Ⅰ/Ⅲ型间同源重组,其中中国蚊虫分离乙脑病毒(SC04-25株)存在9个重组断点,重组断点分布于除基因NS2b和3'非编码区之外的全基因各基因区域;另两株重组病毒分别来自我国黑龙江省和韩国蚊虫标本分离的乙脑病毒(HLJ02-144和K94P05株);精确计算了病毒重组区段位置,各重组区域最相似父本毒株分别分离自乙脑病人和蚊虫标本;本研究还比较了重组毒株与参考毒株间的相似性和遗传距离等。以上结果提示自然界已出现基因重组乙脑病毒,病毒重组事件可以发生在病毒单个基因以致全基因组水平。这是首次发现自然界存在基因Ⅰ/Ⅲ间的乙脑重组病毒。 4.乙型脑炎病毒分子进化研究 本研究利用分子系统发育学与生物信息学技术,计算了乙脑病毒全基因组序列的碱基替换模型、分子钟模型、碱基替换速率以及进化速率,并分别依据遗传距离和进化时间构建了乙脑病毒基因及全基因组的进化树。结果显示,乙脑病毒结构蛋白和非结构蛋白编码基因的最佳碱基替换模型分别是HKY模式和GTR模式,而病毒全基因组序列数据最佳碱基替换模型为GTR模式;乙脑病毒碱基替换速率在10~(-4)数量级,生长进化速率趋近于0,说明乙脑病毒较其他RNA病毒,如流感病毒等生长进化速率缓慢。病毒基因组系统进化分析显示,基因Ⅲ型乙脑病毒的进化关系与宿主来源有关,而基因Ⅰ型乙脑病毒具有地域特征,该结果的发现为乙脑病毒基因型及基因亚型分类以及各地域和各宿主间乙脑病毒的分子差异研究提供了分子依据。本研究还从生物热动力学角度计算了乙脑病毒全基因组各位点生物熵值(0-1.08694),为分析乙脑病毒的保守序列和高变位点提供了分析数据;病毒进化研究结果还显示乙脑病毒起源自公元前801年,基因Ⅲ型和基因Ⅰ型乙脑病毒共进化祖先分别出现在1742年和1798年。以上研究是首次开展的乙脑病毒全基因组分子进化研究。


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