我国手足口病病原学调查及小干扰RNA抑制肠道病毒71型体外复制的研究

【摘要】： 手足口病为我国法定报告的丙类传染病。近年来,手足口病疫情不断暴发,对我国人民的卫生健康造成了严重威胁,成为我国重大的公共卫生事件。本文针对目前我国日趋严重的手足口病,进行了以下两个方面的研究和探索。 一方面,我们针对我国三个主要的手足口病流行地区,山东省、北京市和深圳市,进行了手足口病病原学调查,旨在全面了解引起我国手足口病流行的肠道病毒谱及其分子特征。本文采用M. Steven Oberste和Mark A. Pallansch等设计的对肠道病毒具有高度敏感性和广泛覆盖性的CODEHOP肠道通用引物,运用二步套式PCR体系对来自三个地区的347份手足口病患者咽拭子进了肠道病毒筛查。结果表明,在我国,肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)和柯萨奇病毒A16 (Coxsackievirus A16, CVA16)仍然是我国手足口病的主要病原。分子流行病学分析表明,我国目前流行的EV71病毒仍为C4亚型,而CVA16也与我国一直流行的毒株同属于B1a和B1b亚群。除EV71和CVA16外,还有多种其肠道病毒也可引起手足口病,包括A组柯萨奇病毒(Coxsackie virus A,CVA)的CVA2、CVA4、CVA5、CVA6、CVA10、CVA12和B组柯萨奇病毒(Coxsackie virus B, CVB)的CVB5以及埃可病毒25 (Echovirus, Echo25)。以EV71或CVA16为主,其他多种肠道病毒共存是我国手足口病病原谱的特点。不同地区引起手足口病的肠道病毒优势血清型有所不同。山东、北京,EV71占优势,阳性率分别为58.8%和51.4%。深圳,CVA16占优势,阳性率为50%。非EV71/CVA16肠道病毒在不同地区分布也有所不同：CVB5、CVA2和CVA5只在山东患者样本中检出；CVA4和Echo25只在深圳患者样本中检出；CVA6、CVA10、CVA12在山东和北京患者样本中都能检出。病原谱调查中发现,足口病患者中存在两种甚至三种肠道病毒的混合感染。在347份咽拭子中有4.3%(15份)为混合感染,其中大部分(86.7%)为CVA16和其它肠道病毒混合感染。 在对山东手足口病病原谱调查中发现,CVB5的阳性检出率高达20%,成为临沂地区仅次于EV71的另一重要手足口病病原；此外,由于该地区同时流行多种肠道病毒,为病毒血清型内或之间的基因重组提供了条件。我们对01/CVB5/SD/CHN/09 (CVB5/09)进行了较为详细的分析。利用CVB5／09的基因组VP1 5’端部分序列分别构建进化树,结果显示全球流行的CVB5大致可分为四个基因型(Genotype),其中CVB5／09属基因2型,与我国山东1999年和浙江2002年引起无菌性脑炎的病毒株同属一个基因型,进化关系密切。为了进一步研究CVB5／09分子特征,本文对其进行了基因组测定。与现有的三株CVB5(CVB5/Funlkner、CVB5/UK、CVB5/Korea)基因组比较,基因组核酸序列相似性及编码氨基酸序列相似性分别在80.6%和95%以上。而与其它肠道病毒相比,相似性均在80%以下。此外,我们对另外三个肠道病毒血清型流行株01/CVA4/SHZH/CHN/09 (CVA4/09),01/CVA5/SD/CHN/09 (CVA5/09)和01/CVA10/SD/CHN/09 (CVA10/09)进行了全基因组测序和基因组注释,然后进一步对基因特征进行了分析。结果表明,三株病毒株的基因组结构与其它肠道病毒基因组结构特征相似。进化分析表明,用3D区构建的进化树中,CVA5／09和CVA10／09共同形成独立的分支,表明在不同血清型肠道病毒共循环的过程中,可能发了血清型间重组。我们用Simplot软件对在我国流行的几株肠道病毒及其各自的参比株进行了相似性分析,表明CVA5／09和CVA10／09之间可能发生了基因重组。 另一方面,本文针对引起我国手足口病流行的主要病原体EV71,进行了抑制EV71体外复制的干扰RNA的筛选。通过INVITROGEN在线工具设计并化学合成了分别针对EV71 VP2和VPl基因的三对siRNAs, Stealth-990 (VP2), Stealth-2570 (VP1)和Stealth-3020 (VP1).利用EV71感染RD细胞模型,通过Real-time PCR测定病毒感染细胞中病毒mRNA序列拷贝数和测定病毒感染细胞上清病毒滴度TCID50,分别在mRNA水平和病毒滴度水平对siRNAs体外抑制EV71病毒复制的抗病毒效果进行了评价,同时就siRNAs对不同毒株的抗病毒效果进行了比较。结果表明,针对保守区设计的三对Stealth siRNAs不仅可以有效地抑制EV71 SHZH98的体外复制,而且可有效地抑制不同病毒株Fuyang0805的体外复制；有效的siRNAs的混合制剂同样能抑制病毒的复制。 近几年我国大规模发生的HFMD暴发疫情,尤其是在疫情中EV71感染引起的神经性疾病的迅速增加,严重危害婴幼儿、尤其是农村地区婴幼儿的身体健康。加强对手足口病病原学的了解和对EV71感染患者的救治,对于预防控制手足口病疫情,减少致死率,具有重要的社会意义和经济价值。