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提高广谱流感疫苗NM2e免疫效果的佐剂研究

蒋涛  
【摘要】: 广谱流感疫苗对防控流感大流行具有重要意义。十几年来,广谱流感疫苗的研究取得了重要进展。本课题研发的在大肠杆菌中表达的NP与M2e融合蛋白NM2e的亚单位疫苗,因生产成本低、可大规模生产和反复使用等优点,具有良好的开发前景。但这种疫苗免疫原性弱,需要佐剂才能诱发有效和长期的免疫保护。 铝佐剂是目前最广泛应用的一类疫苗佐剂,但主要诱发Th2型免疫反应。CpG是被广泛研究过的Th1型佐剂,能诱发较强的细胞免疫,但目前尚未被批准市售。一些化学药物如左旋咪唑(Levamisole, LMS)、西米替丁(Cimetidine, Cim)、伐地那非(Vardenafil, Var,品牌名:艾力达)、PolyⅠ:C等在人体中具有一定的免疫调节作用,文献报道这类化学药物对乙肝抗原具有明显的佐剂效应。由于这类药物价格低廉,有人体长期应用经验,毒副作用清楚,一旦开发成为佐剂,将具有重要应用前景。因此,对这类药物在蛋白亚单位疫苗中佐剂效应的研究已成为佐剂研究的新策略。为此,本研究选用了NM2e为抗原,对Al(OH)3、CpG、LMS、Cim、Var、Poly I:C的佐剂效应进行比较研究。 本研究首先对NM2e蛋白进行了批量纯化,使用纯化抗原对Al(OH)3与CpG的佐剂效应进行了研究,在此基础上将LMS、Cim、Var、Poly I:C四种药物单独或与Al(OH)3联合制备NM2e亚单位疫苗,通过免疫小鼠的体液免疫、细胞免疫及攻毒后的保护效果,对这四种药物作为NM2e蛋白疫苗佐剂的可能性进行了比较研究。主要研究结果如下: 1、利用表达条件IPTG=0.1mM, OD600=0.8, t=10h, T=25℃能使原核表达质粒pET30a-NM2e可溶性表达NM2e蛋白,用阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化工艺,从10L菌液中批量制备获得了质量一致、纯度为90%的70mg NM2e蛋白,经Western-blot鉴定蛋白正确。 2. Al(OH)3佐剂可以显著提高NM2e蛋白诱发的特异性IgGl滴度,可使攻毒后小鼠的存活率提高至70%(7/10)。CpG佐剂可以明显提高NM2e蛋白诱发的特异性IgG2a滴度,攻毒后小鼠的存活率提高至30%(3/10)。Al(OH)3与CpG联合使用作为佐剂,NM2e蛋白的特异性IgG1、IgG2a滴度显著高于CpG佐剂组,NM2e蛋白的特异性IgGl与单独使用Al(OH)3无显著差别,但IgG2a滴度高于Al(OH)3佐剂组,攻毒后小鼠发病最轻,体重恢复最快,小鼠的存活率为100%。 3、左旋咪唑对NM2e蛋白亚单位疫苗无明显佐剂效应,但与Al联合使用可使攻毒后存活小鼠体重恢复加快。西米替丁可以明显提高NM2e蛋白诱发的特异性IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(30%),但保护效果明显低于Al(70%),与Al无明显协同作用。伐地那非能明显增加NM2e蛋白诱发的特异性IgG1、IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(36%),但与Al联合使用降低了Al的免疫保护。Poly I:C能明显增加NM2e蛋白诱发的特异性IgG滴度,倾向于提高Th1型免疫反应,能提高攻毒后小鼠的存活率(20%),但保护效果明显低于Al,与Al联合使用对小鼠的攻毒保护率有一定程度的提高。 以上实验结果证明,NM2e蛋白在大肠杆菌中获得了批量表达和纯化;Al和CpG佐剂均可以增强NM2e蛋白的免疫反应,均能提高攻毒保护效果,二者联合使用具有明显的协同作用;左旋咪唑、西米替丁、伐地那非、Poly I:C对NM2e蛋白均有一定的免疫调节作用,其中西米替丁和伐地那非能提高攻毒保护效果,但保护效果明显均低于Al,与Al联合使用均无明显协同作用,Poly I:C与Al联合使用的的协同作用尚需进一步研究。


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