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氡致肺癌及肺损伤相关microRNAs的研究

高刚  
【摘要】: 背景 氡及子体已成为仅次于吸烟的第二大肺癌相关的环境和职业致癌因子。人类肺癌的10%左右可归因于氡及其子体的辐射。流行病学调查已证实,高浓度的氡暴露可增加肺癌发生的危险度。大量动物和细胞实验研究表明,氡暴露可诱导肺癌的发生。微小RNA(microRNA)是一类18~24nt的非编码RNA分子。MicroRNA普遍存在于生物界,具有高度的保守性,广泛参与细胞生长、分化、发育、细胞凋亡和肿瘤发生等多方面的基因表达调控。到目前为止,成熟microRNA的总数已达10581种,其中,在人类基因组中已发现721种。据推测人类microRNA的总数将达到1000多种。通过与靶基因3端非翻译区互补配对,microRNA对靶基因mRNA进行降解或翻译抑制。根据生物信息学预测,每种microRNA可调控200多种靶基因,这意味着超过30%的人类蛋白编码基因受其调控。对肿瘤microRNA表达谱的研究,已经得到了与肿瘤诊断、分期、发展和治疗效果相关的标志性microRNA。其中与肺癌相关的microRNA有let-7家族、miR-34家族和miR-29家族等。 目的 利用α粒子诱发BEP2D恶性转化模型、氡染毒小鼠模型、高氡暴露地区居民肺癌标本进行氡致肺癌及肺损伤相关microRNAs的研究,探讨microRNA在氡致肺癌及肺损伤中的调节作用和分子机制,为氡致肺癌及肺损伤中的诊断和治疗提供理论依据。 方法 1.利用miRNA芯片筛选α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的miRNAs; 2.通过TaqMan qPCR检测miR-200家族在α粒子恶性转化细胞模型中的表达对miRNA芯片的结果进行验证; 3.通过qPCR检测α粒子恶性转化细胞模型中ZEB家族和上皮间质转变标志分子mRNA的表达; 4.利用Western Blot和免疫荧光技术检测α粒子恶性转化细胞模型中ZEB家族和上皮间质转变标志分子蛋白水平的表达; 5.通过细胞转染,利用ZEB1特异的SiRNA下调RHT35细胞中ZEB1的表达,利用miR-200家族特异的模拟物上调RHT35细胞中miR-200家族的表达,探讨miR-200家族在RHT35细胞中下调的机制; 6.用伤口愈合分析研究过表达miR-200b和miR-141对RHT35细胞的迁移功能的影响; 7.利用ELISA试剂盒检测BEP2D、RH20和RHT35细胞分泌到培养液中TGFβ1的浓度; 8.TGFβ1作用RH20细胞48h后,qPCR和免疫荧光技术检测miR-200家族、ZEB家族及EMT相关Marker在RH20细胞中的表达,探讨TGFβ在RHT35细胞发生上皮间质转变中的作用; 9.用氡室制备氡染毒小鼠模型; 10.用TaqMan qPCR检测氡染毒小鼠肺组织中let-7、miR-29和miR-34家族的表达; 11.用Western Blot检测氡染毒小鼠肺组织中let-7家族靶蛋白CDK6和RAS的表达; 12.用TaqMan qPCR检测高氡暴露地区居民肺癌组织中let-7、miR-29、miR-34和miR-200家族的表达。 结果 1.miRNA芯片筛选出了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达miRNAs:(1)与BEP2D细胞相比,RH20细胞中存在38个差异表达miRNAs,其中18个表达上调,20个表达下调;(2)与BEP2D细胞相比,RH20和RHT35细胞中变化一致的差异表达miRNAs有25个,其中10个表达上调,15个表达下调;(3)与BEP2D细胞相比,RHT35细胞中存在87个差异表达miRNAs,其中47个表达上调,40个表达下调;(4)与RH20细胞相比,RHT35细胞中存在38个差异表达miRNAs,其中20个表达上调,18个表达下调; 2.TaqMan qPCR检测结果显示:与BEP2D和RH20细胞相比,RHT35细胞中miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141的表达显著下调,P0.01,与miRNA芯片结果相一致; 3.qPCR检测结果显示:(1)与BEP2D和RH20细胞相比,RHT35细胞中ZEB1和ZEB2的mRNA表达显著上调,分别上调9.44和27.56倍,P0.01,表明RHT-35细胞中miR-200家族与ZEB家族的表达存在反向关系;(2)与BEP2D和RH20细胞相比,RHT35细胞中上皮型标志分子E-cadherin mRNA的表达下调4.40倍,而间质型标志分子N-cad mRNA的表达上调4.30倍,P0.01,表明RHT-35细胞在α粒子诱发恶性转化过程中发生了上皮间质转变; 4.Western Blot和免疫荧光技术检测结果显示:(1)与BEP2D和RH20细胞相比,RHT35细胞中ZEB1和ZEB2蛋白水平的表达显著上调;(2)与BEP2D和RH20细胞相比,RHT35细胞中上皮型标志分子E-cadherin蛋白水平的表达显著下调,而间质型标志分子N-cadherin蛋白水平的表达显著上调; 5.与Negative control转染组相比,SiZEB1转染组中ZEB1的mRNA和蛋白表达显著下调,表明SiZEB1转染成功抑制RHT35细胞中ZEB1的表达;与Negative control转染组相比,SiZEB1转染组中miR-200c和miR-141表达出现显著上调,而miR-200a和miR-200b表达未出现明显改变,表明抑制ZEB1能上调RHT35细胞中miR-200c和miR-141的表达; 6.与mimic control转染组相比,miR-200b mimic和miR-141 mimic转染组中miR-200靶基因ZEB家族及TGFβ2表达显著下调,表明ZEB家族和miR-200家族之间的双向负反馈调控环;与mimic control转染组相比,miR-200b mimic和miR-141 mimic转染组中E-cad mRNA表达显著上调,而N-cad表达显著下调,表明过表达miR-200b和miR-141对RHT35细胞的EMT有抑制作用,可能通过miR-200b和miR-141靶向ZEB家族而发挥作用; 7.伤口愈合分析显示:与mimic control转染组相比,miR-200b mimic和miR-141 mimic转染组能显著抑制RHT35细胞迁移功能; 8.与BEP2D和RH20细胞相比,RHT35细胞分泌到培养液中TGFB1浓度显著增加,P0.05;与对照组相比,TGFD1作用组RH20细胞形态由鹅卵石样上皮型转变为纺锤样间质细胞;与对照组RH20细胞相比,TGFD1作用组RH20细胞中ZEB家族和间质型标志分子N-cadherin、Vimentin和Fibronectin mRNA的表达显著上调,P0.01;与对照组RH20细胞相比,TGFD1作用组RH20细胞中miR-200a、miR-200c和miR-141的表达显著下调,表明TGFβ1能诱导RH20细胞发生上皮间质转变; 9.与对照组相比,30WLM和60WLM氡染毒1个月处理组及3个月处理组肺组织中let-7a、let-7c和let-7f的表达显著下调,30WLM和60WLM氡染毒即刻处理组肺组织中let-7a、let-7c和let-7f的表达差异没有统计学意义;与对照组相比,60WLM氡染毒各组小鼠肺组织miR-29家族和miR-34家族的表达差异没有统计学意义; 10.与对照组相比,60WLM氡染毒1个月处理组小鼠肺组织CDK6的表达显著增高,而RAS的表达没有明显改变,验证了let-7对靶蛋白CDK6的负调控; 11.与对照组相比,高氡暴露地区居民肺癌组织中let-7a、let-7c、let-7f、miR-29家族、miR-34家族、miR-200a和miR-200b的表达显著下调,P0.05,而miR-200c的表达差异没有统计学意义;用独立样本的t检验对miR-200家族的表达改变与肺癌分化程度进行分析,结果发现miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达在肺癌分化程度组间差异没有统计学意义。 结论 1.α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期存在差异表达miRNAs,提示miRNAs与α粒子诱发细胞恶性转化过程密切相关; 2.α粒子早期转化和恶性转化细胞中存在变化一致的差异表达miRNAs,提示这些差异表达miRNAs具有作为α粒子诱发细胞恶性转化早期诊断生物标志物的应用前景; 3.ZEB1过表达可能是RHT35细胞中miR-200c和141表达下调的机制; 4.α粒子诱发细胞恶性转化过程中细胞发生了上皮间质转变,TGFβ可能在上皮间质转变中具有重要作用; 5.过表达miR-200b和miR-141对RHT35细胞的上皮间质转变和迁移功能有抑制作用; 6.Let-7家族的表达下调可能是氡致肺癌和肺损伤的早期事件,表明let-7家族可能在氡致肺癌和肺损伤的发生和发展中发挥重要作用。 7.MiR-29、miR-34和miR-200家族的表达下调可能与氡致肺癌的发生和发展过程密切相关。


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