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采用噬菌体展示技术淘选河豚毒素模拟表位的研究

张林  
【摘要】: 河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)是一种毒性很强的非蛋白类神经毒素,该毒素作用于中枢及周围神经系统,选择性地与细胞膜表面的钠离子通道上的蛋白质结合,从而阻断钠离子通道,直接影响神经肌肉兴奋性的传导,使得神经肌肉呈麻痹状态,甚至引起死亡。该毒素理化性质稳定,能耐高温及日光暴晒,家庭的烹饪过程几乎不破坏其毒性。河豚毒素在临床上可用做止痛剂、麻醉剂和降压药等等,但需慎重把握其用量。目前国际上TTX标准品价格不菲且TTX属于生物战剂遭到国际禁运,此外TTX是剧毒物对实验操作人员也存在安全隐患。因而如果能制备一种河豚毒素的替代物,并对其性质进行研究鉴定,无论是用于无毒检测方法的研究,还是做为药物筛选的前提,都具有较大意义。 曾有学者使用抗抗河豚毒素单克隆抗体独特型抗体(AID)替代河豚毒素用于ELISA检测,但由于抗独特型抗体与抗体之间的亲和力通常高于抗体与毒素之间的亲和力,因此制备的AID不能替代结合态TTX包被酶标板用于ELISA,而且抗独特型抗体的筛选相当繁琐。噬菌体随机肽库技术的出现为这个问题的有效解决提供了新的手段。噬菌体随机肽库技术是以大量随机编码的多肽序列插入噬菌体载体,形成噬菌体展示文库,每个噬菌体粒子表面只展示一种序列的外源肽链,并保持其相对的空间构象和生物活性。本研究通过以抗TTX的单抗为配基,从噬菌体随机肽库中筛选与之特异性结合的TTX模拟表位,以筛选出来的抗原表位合成多肽替代TTX毒素,并对多肽的性质进行初步鉴定。主要研究内容如下: 以抗TTX单克隆抗体作为靶分子,对融合表达在M13丝状噬菌体衣壳蛋白表面的随机七肽库进行亲和淘选,通过ELISA方法筛选和鉴别具有模拟表位的阳性噬菌体克隆,并用阳性克隆建立ELISA分析方法;通过对阳性克隆进行DNA测序确定插入序列的氨基酸序列,同时经化学方法合成多肽,对模拟表位进行验证。通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到了3株能抑制TTX的阳性克隆。其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1~20ng/ml (TTX毒素浓度),R2=0.9947,50%抑制率为4ng/ml,检测下限(20%抑制率)为1ng/ml。使用该方法与常规ELISA检测方法同时检测样品,结果基本无差异。经DNA测序分析,模拟表位肽的共有序列是组氨酸-甘氨酸-脯氨酸-酪氨酸-精氨酸-组氨酸-脯氨酸。 根据DNA测序分析结果,合成多肽(HGPYRHP),并建立免疫检测方法,其线性范围为1-20μg/ml, R2= 0.9995,20%抑制率为1.2μg/ml,50%抑制率6.3μg/ml。分别以不同浓度的TTX标准品与合成多肽建立ELISA分析方法的竞争曲线,通过参照标准曲线中相同结合率时TTX标准品与合成多肽的浓度,可得到TTX标准品与合成多肽的剂量关系,二者呈现良好的线性,其R2=0.9978,表明该多肽可用于替代TTX标准品用于TTX的ELISA检测。


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