波动性高血糖对血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路的影响及西洋参茎叶总皂苷的干预研究

【摘要】：2型糖尿病是冠心病的等危症,内皮功能异常是糖尿病心血管并发症发生发展的重要病理生理基础。临床上糖尿病患者高血糖多处于波动状态,波动性高糖相对于持续性高血糖危害性更大,更能促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生与发展,因此对其具体机制及有效的抗波动高糖内皮损伤手段的研究已成为糖尿病血管并发症防治领域的热点之一。西洋参茎叶总皂苷(PQS)作为益气养阴中药西洋参的有效部位,同时具有调脂、降糖和改善心肌缺血等作用,既往研究也提示PQS可能是通过促进脂肪细胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)途径信号转导而增加胰岛素敏感性、发挥调节糖脂代谢的作用。PI3K/Akt信号通路在细胞的凋亡、存活以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能,研究证实其在血管病变的生理病理过程中具有特殊的作用。 基于此,本研究借助波动性高血糖大鼠模型、波动性高血糖培养人脐静脉内皮细胞模型,检测不同高血糖状态(稳定性高血糖和波动性血高糖)对血管内皮形态和功能损伤的影响,并结合炎症、凋亡和氧化应激及PI3K/Akt信号通路关键蛋白的表达变化,探讨波动性高糖加重内皮损伤的分子机制,并探索PQS抗波动性高血糖内皮损伤的作用环节,为PQS防治糖尿病、冠心病等代谢相关性疾病的临床应用提供实验依据。 本课题研究分为三部分：文献综述,动物实验研究和细胞实验研究。 1文献综述：本部分分别从波动性高血糖与心血管并发症、PI3K/Akt信号通路与糖尿病血管内皮功能异常两个方面进行综述。 2动物实验研究：波动性高血糖对2型糖尿病大鼠血管内皮功能及PI3k/Akt信号通路的影响及西洋参茎叶总皂苷的干预效应研究 目的：观察波动性高血糖状态对2型糖尿病大鼠血管内皮功能及PI3k/Akt信号通路的影响及PQS的干预机制。 方法：采用高脂饲料喂养加链脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 35mg/kg腹腔注射建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,并依照空腹血糖水平和血糖变异系数(FBG-CV)将造模成功的T2DM大鼠分为波动高糖组和稳定高糖组(SHG组),然后将波动高糖组随机分为六组：PQS低剂量组(PQL组)高剂量组(PQH组)、盐酸二甲双胍低剂量组(MEL组)、高剂量组(MEH组)、α-硫辛酸组(α-LA组)及波动性高血糖对照组(FHG组),除FHG组灌服等体积蒸馏水外,其余各组灌服相应药物。干预8周后,所有大鼠禁食12小时,麻醉,腹主动脉采血,分离血清,血浆。取从肾动脉开口处到升主动脉段的主动脉,上端2cm用于常规HE染色,其余部分迅速冻存于液氮中,2h后置于-80℃冰箱保存,用于western-blot检测。进行大鼠主动脉组织病理学观察,ELISA法测定血浆肝细胞生长因子(HGF)、AGEs、LOX-1、ET-1、TNF-a及sICAM-1含量,生化法测定大鼠血清SOD、MDA含量。Western blot法检测大鼠主动脉p-GSK-3β、p-Akt, GSK-3β和Akt蛋白水平。 结果： ①生化指标检测显示：与正常组相比,稳定高糖组和波动高糖组糖尿病大鼠血浆HGF及血清AGES、LOX-1、NO、MDA、ET-1、TNF-α、sICAM-1含量均明显增多,SOD含量明显减少(P0.05或P0.01)；与稳定高糖组比较,波动高糖组AGEs、LOX-1、NO、MDA、ET-1、TNF-α、sICAM-1含量进一步显著增加(P0.01),而SOD则显著减少(P0.01);与波动高糖组相比,高、低剂量PQS,二甲双胍组及α-LA组大鼠血浆HGF及血清AGEs、LOX-1、NO、MDA、ET-1、TNF-α、sICAM-1含量均显著降低(P0.01),大鼠血清SOD含量明显升高(P0.01)。 ②GSK-3β和Akt蛋白检测显示：与正常组相比,稳定高糖组和波动高糖组大鼠主动脉GSK-3β和Akt蛋白磷酸化水平明显降低(P0.01),波动组较稳定组又进一步降低(P0.01)；与波动高糖组相比,高、低剂量PQS,二甲双胍及α-LA组大鼠主动脉GSK-3β和Akt蛋白磷酸化水平均明显升高(P0.01)。 ③组织病理学观察显示：各组大鼠主动脉血管内皮结构并未见显著病理学差异。 结论： ①2型糖尿病大鼠体内存在明显的内皮损伤和功能障碍,分析其与氧化应激,炎症反应激活,糖基化终末产物蓄积及血管内皮损伤介质LOX-1的过表达有关,且高糖状态下PI3K/Akt信号通路相关蛋白活性降低,而波动性高血糖则进一步加剧了这一病理过程； ②PQS对2型糖尿病大鼠波动性高血糖状态下血管内皮功能损伤具有明显的保护作用,其保护机制与其调节糖脂代谢、减轻氧化应激及炎症反应、减少糖基化终末产物蓄积及抑制血管内皮损伤介质LOX-1的过表达,及上调PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达、促进Akt及GSK-3β磷酸化密切相关。 3细胞实验研究 研究一波动性高血糖对人脐静脉内皮细胞及PI3k/Akt信号通路的影响 目的：观察波动性高血糖对人脐静脉内皮细胞及PI3k/Akt信号通路的影响。 方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞为研究对象,予不同条件葡萄糖浓度分3组培养：稳定性正常浓度葡萄糖组(glucose:5.56 mmol/L)(正常低糖,NOR)；稳定性高浓度葡萄糖组(glucose:25mmol/L)(稳定高糖,SHG)；波动性高浓度葡萄糖组(间替高糖型DMEM全培养基/低糖型DMEM全培养基培养,每24 h换液)(波动高糖,FHG)。并分别对稳定高糖和波动高糖组进行LY294002和CsA干预,预处理1小时,浓度分别为20umol/L和2umol/L。包括稳定高糖+LY294002组(SHL),波动高糖+LY294002组(FHL),稳定高糖+CsA组(SHC),波动高糖+CsA组(FHC)。细胞培养8天,进行细胞形态学观察和细胞活性检测,取细胞培养上清液检测NO ET-1、TNF-α、sICAM-1、LOX-1含量,细胞裂解液检测胞内NOS、SOD、MDA水平。Western blot法检测细胞p-GSK-3β, p-Akt, GSK-3β和Akt蛋白水平。 结果： ①细胞形态学观察和细胞活性检测显示：与正常组相比,稳定高糖组和波动高糖组细胞出现明显的肿胀、凋亡和坏死,细胞活性明显降低(P0.01),LDH漏出率明显增加(P0.01),且波动高糖组LDH漏出率明显进一步增加(P0.05),细胞活性进一步降低(P0.01)；运用LY294002预处理后,LDH漏出率明显增加(P0.01或P0.05),细胞活性均出现明显下降(P0.01)；而运用CsA预处理后,LDH漏出率明显减少(P0.01),细胞活性则显著升高(P0.01)。 ②生化指标检测显示：与正常组相比,稳定高糖组和波动高糖组细胞培养上清中NO、ET-1、TNF-α、sICAM-1、LOX-1及细胞裂解液检测胞内NOS、MDA含量均明显增加(P0.01或P0.05),波动组进一步明显增加(P0.01或P0.05)；波动组较稳定组细胞培养上清SOD水平下降明显(P0.05)；运用LY294002预处理后,NO、ET-1、TNF-α、sICAM-1、LOX-1及NOS、MDA含量均显著增加(P0.01或P0.05),SOD含量明显降低(P0.01或P0.05)；而运用CsA预处理后,结果则与LY294002相反(P0.01)。 ③GSK-3β和Akt蛋白检测显示：与正常组相比,稳定高糖组和波动高糖组细胞蛋白GSK-3p和Akt磷酸化水平均明显降低(P0.01),而波动组进一步明显降低(P0.01)；运用LY294002预处理后,细胞蛋白GSK-3p和Akt磷酸化水平均进一步降低(P0.01或P0.05)；而运用CsA预处理后,各组细胞蛋白磷酸化水平则出现明显升高现象(P0.01)。 结论： 高糖状态能够诱导内皮细胞功能障碍和损伤,其机制与氧化应激,炎症反应激活,LOX-1过表达,进而PI3K/Akt信号通路相关蛋白活性下降及MPTP开放密切相关,波动性高血糖进一步加剧了这一病理过程。 研究二PQS抗波动性高血糖内皮细胞损伤的相关机制研究目的：观察PQS对波动性高血糖状态下人脐静脉内皮细胞的保护作用及相关机制。方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞为研究对象,药物干预条件分为一下5种情况：PQS高剂量(0.1mg/ml, PH), PQS低剂量(0.05mg/ml, PL),洋参二醇皂苷组(0.08mg/ml, DS),盐酸二甲双胍组(1mM, MH)和α-硫辛酸组(100umol/L,α-LA)。同时对各用药组进行LY294002(终浓度20umol/L)预处理1小时。分别为PQS高剂量+LY294002组(以下简称：PHL),PQS低剂量+LY294002组(以下简称：PLL),洋参二醇皂苷+LY294002组(以下简称：DSL),盐酸二甲双胍组+LY294002组(以下简称：MHL),α-硫辛酸组+LY294002组(α-LAL)。细胞培养8天,进行细胞形态学观察及相关指标检测(同研究一)。 结果： ①细胞形态学观察和细胞活性检测显示：与波动高糖组相比,PQL、PQH、DS、MH及α-LA组细胞形态均明显好转,细胞活性明显升高(P0.01),LDH漏出率显著降低(P0.01)；运用LY294002预处理后,除DSL组以外,其余各组细胞活性均出现明显下降(P0.01),LDH漏出率明显增加(P0.01)。 ②生化指标检测显示：与波动高糖组相比,PQL、PQH、DS、MH及α-LA组细胞培养上清中NO、ET-1、TNF-α、sICAM-1、LOX-1及细胞裂解液检测胞内NOS、MDA含量均明显降低(P0.01或P0.05),细胞培养上清SOD水平明显增加(P0.01或P0.05)；运用LY294002预处理后,除DSL组以外,其余各组细胞NO、ET-1、TNF-α、sICAM-1、LOX-1及NOS、MDA含量均显著增加(P0.01或P0.05),SOD水平则明显降低(P0.01或P0.05)。 ③GSK-3β和Akt蛋白检测显示：与波动高糖组相比,PQS、DS及MH组细胞蛋白GSK-3β和Akt磷酸化水平均明显升高(P0.01)；运用LY294002预处理后,除DSL组以外,其余各组细胞蛋白GSK-3β和Akt磷酸化水平均明显降低(P0.01)。 结论： ①PQS对波动性高血糖状态下人脐静脉内皮细胞具有明显的保护作用； ②PQS的保护作用可能与其减轻氧化应激及炎症反应,抑制LOX-1的过表达,并通过上调PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达、促进Akt及GSK-3β磷酸化而发挥作用； ③另外本研究还发现了一个比较有趣的现象,即西洋参茎叶总皂苷(PQS)作用的发挥与PI3K/Akt信号通路密切相关,运用LY294002阻断该通路可以显著的影响PQS作用的发挥,但是作为其重要组分且已经作为注射液运用到临床中的洋参二醇组(洋参通脉注射液)则与PI3K/Akt信号通路相关性不大。