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桂枝汤及其体外消化道模拟产物的药效学研究

陈冰  
【摘要】:针对中药制剂工艺落后、粗放,无法进行定量控制并制定相应的标准,因而成为影响中药制剂疗效稳定性等现状,从中医辨证论治的整体效应出发,在前期工作中,根据中药传统服药方式,综合采用酶解、微生物转化和膜滤技术,成功建立了标准化中药汤剂整体效应分子组的生物模拟集成技术。并应用该技术对作用机制较明确的复方中药桂枝汤进行了分离纯化试验,结果提示,桂枝汤生物转化模拟产物成分与口服桂枝汤汤剂后大鼠门静脉血中成分基本一致。本课题针对上述技术,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印记法(Western blot),观察桂枝汤及其生物转化模拟产物对白细胞介素-1β(IL-1β)刺激的脑微血管内皮细胞(bEnd.3株)p38MAPK, cPLA2, sPLA2, COX-2, PGES,15-PGDH, NF-κB以及PGE2分泌及表达的影响。研究桂枝汤及其生物转化模拟产物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞PGE2代谢通路的影响。希望能为该技术提供实验依据,并为进一步探索中药药效物质基础提供了新的方法学启示,也为中药复方剂型改进、发现及创制新型中药提供实验支持。 1桂枝汤、桂枝汤体外生物转化模拟产物及其含药血清的制备 以常规方法制备桂枝汤。桂枝汤体外生物转化模拟产物(以下简称模拟药)制备:20 mL桂枝汤汤剂(1.0 g饮片/mL)加入100mL蛋白质浓度为1300 mg·L-1的菌酶溶液(pH 7.5)中,充氮,42℃培养36 h,反应完成后7000 r·min-1离心15 min。取上清液,以膜孔径50万道尔顿的超滤柱纯化,收集超滤液,减压浓缩至1.0 g饮片/mL。发现肠内菌酶对桂枝汤的转化作用与消化道对桂枝汤的消化作用相类似。采用常规方法制备二者含药血清。所得产物用于下一步药效学研究。 2桂枝汤对发热大鼠的解热作用 本实验发现,酵母可使大鼠体温明显升高。桂枝汤大、小剂量组均可使大鼠体温明显下调,桂枝汤小剂量组在给药后2 h及3 h,桂枝汤大剂量组在给药后1h及2 h产生效应。阿司匹林组在给药后1 h,2 h及3 h均可显著抑制大鼠体温上升。酵母造模3.5 h后,大鼠血清IL-1β, PGE2含量明显上升,桂枝汤大、小剂量组及阿司匹林组均可明显下调大鼠血清IL-1β, PGE2含量。实验证明桂枝汤具有解热作用,可能与调节血清IL-1β, PGE2含量有关。 3药物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞p-p 38 MAPK表达的影响 实验结果提示,IL-1β作用于bEnd.310 h后,细胞p 38 MAPK表达无明显变化,桂枝汤含药血清、模拟药、模拟药含药血清各浓度组对p 38 MAPK表达也无明显影响;而p-p 38 MAPK蛋白在IL-1β作用下表达显著增加,桂枝汤含药血清、模拟药、模拟药含药血清各浓度组均可降低IL-1β诱导的p-p 38 MAPK蛋白的表达,桂枝汤含药血清及模拟药含药血清作用呈现量效关系。 4药物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞PLA2分泌及表达的影响 ELISA结果提示,IL-1β作用于细胞10 h后,细胞外液cPLA2及sPLA2含量均显著升高,除桂枝汤含药血清2.5%组对cPLA2、模拟药含药血清2.5%组对cPLA2及sPLA2未见明显作用外,桂枝汤含药血清、模拟药及模拟药含药血清各浓度组均可显著降低细胞外液cPLA2及sPLA2含量,且呈现明显的浓度依赖。药效曲线比较发现,在对cPLA2作用上,桂枝汤含药血清及模拟药基本相当,略好于模拟药含药血清。而在对sPLA2作用上,药物不同处理后作用基本相当。根据课题组以往对含药血清在体外实验系统中用量的研究结果计算含药血清的剂量,以g饮片/kg体重/U表示。g饮片/kg体重,即动物口饲给药剂量;U,系含药血清在体外系统中的稀释倍数;g饮片/kg体重/U,即动物口饲给药剂量除以含药血清在体外系统中的稀释倍数。 按上述公式计算,结果显示,桂枝汤含药血清、模拟药含药血清抑制细胞外液cPLA2含量的IC50分别为10.199,11.468 g饮片/kg体重/U,模拟药抑制细胞外液cPLA2含量的IC50为52 g/L。桂枝汤含药血清、模拟药含药血清抑制细胞外液sPLA2含量的IC50分别为6.909,7.379 g饮片/kg体重/U,模拟药抑制细胞外液sPLA2含量的IC50为44 g/L。 Western blot检测显示,IL-1β作用于细胞10 h后,与对照组相比,细胞cPLA2蛋白表达显著增加,桂枝汤含药血清组、模拟药组、模拟药含药血清组均可降低IL-1β诱导的cPLA2蛋白的表达。 5药物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞COX-2表达的影响 Western blot检测显示,IL-1β作用于细胞10 h后,与对照组相比,细胞COX-2蛋白表达显著增加,桂枝汤含药血清、模拟药、模拟药含药血清均可抑制1L-1β刺激的bEnd.3细胞COX-2蛋白表达。其中,桂枝汤含药血清组随着药物浓度增大,效果更加明显,20%组效果最显著;模拟药1%浓度组作用不显著,2%,4%浓度组作用逐渐增强。模拟药含药血清5%,10%浓度组作用不显著,20%浓度组效果最显著。 6药物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞PGES胞外浓度及表达的影响 ELISA结果显示,IL-1β作用于细胞10 h后,细胞外液PGES含量显著升高。桂枝汤含药血清、模拟药、模拟药含药血清均可抑制IL-1β刺激的bEnd.3细胞PGES的外漏,且均呈现较明显的浓度依赖趋势。其中,除桂枝汤含药血清及模拟药含药血清2.5%浓度组、模拟药1%浓度组作用不明显外,其它各组均呈现显著性差异。经计算,桂枝汤含药血清、模拟药含药血清抑制细胞外液PGES含量的IC50分别为10.575,13.207 g饮片/kg体重/U,模拟药抑制细胞外液PGES含量的IC50为40 g/L Western blot检测显示,IL-1β作用于细胞10 h后,与对照组相比,细胞PGES蛋白表达显著增加,桂枝汤含药血清10%,20%浓度组均可明显降低IL-1β诱导的PGES蛋白的表达。模拟药各浓度组对PGES蛋白的表达未见明显影响。模拟药含药血清也能降低PGES蛋白的表达,10%浓度组效果最显著。 7药物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞15-PGDH胞内外表达的影响 IL-1β作用于细胞10 h后,细胞外液15-PGDH含量显著升高。桂枝汤含药血清、模拟药及模拟药含药血清各浓度组均可显著降低IL-1β诱导的bEnd.3细胞外液15-PGDH的表达,且呈现量效关系。经计算,桂枝汤含药血清、模拟药含药血清抑制细胞外液15-PGDH含量的IC50分别为8.554,10.434 g饮片/kg体重/U,模拟药抑制细胞外液15-PGDH含量的IC50为45 g/L Western blot检测显示,IL-1β作用于细胞10 h后,与对照组相比,细胞15-PGDH蛋白表达显著增加,桂枝汤含药血清5%,10%,20%浓度组均可显著降低IL-1β诱导的15-PGDH蛋白的表达,5%,10%组差别不大,20%组效果最显著。模拟药1%,2%浓度组对IL-1β刺激的15-PGDH蛋白的表达未见明显影响,4%浓度组可显著降低15-PGDH蛋白的表达。模拟药含药血清5%,10%,20%浓度组均可显著降低IL-1β诱导的15-PGDH蛋白的表达,随药物浓度升高,作用更加明显。 8药物对IL-1β刺激的bEnd.3细胞NF-κB表达的影响 实验发现,IL-1β对bEnd.3细胞NF-κB蛋白表达无显著影响,可使p-NF-κB蛋白表达明显增加,桂枝汤含药血清、模拟药、模拟药含药血清低浓度组对p-NF-κB的作用均不明显,高浓度组可显著降低p-NF-κB蛋白的表达。 9药物对IL-1p刺激的bEnd.3细胞PGE2分泌的影响 IL-1β作用于细胞10 h后,细胞外液PGE2含量显著升高。桂枝汤含药血清、模拟药物及模拟药含药血清均可显著降低IL-1β诱导的PGE2的表达,且呈现量效关系。药效曲线比较发现,在低浓度区域,模拟药效果较好,到高浓度处与桂枝汤含药血清重合,但均强于模拟药含药血清。经计算,桂枝汤含药血清、模拟药含药血清抑制细胞外液PGE2含量的IC50分别为8.601、10.528 g饮片/kg体重/U,模拟药抑制细胞外液PGE2含量的IC50为56 g/L。 综上所述,桂枝汤可显著降低酵母诱导的大鼠体温升高,其机制可能与降低大鼠血清IL-1β, PGE2的含量有关。桂枝汤含药血清及生物转化模拟产物含药血清可降低IL-1β刺激的bEnd.3细胞p-p 38 MAPK, cPLA2, sPLA2, COX-2, PGES, 15-PGDH, p-NF-KB以及PGE2的分泌及表达,桂枝汤生物转化模拟产物除对PGES蛋白表达作用不明显外,对其它指标均产生显著影响。桂枝汤生物转化模拟产物抑制细胞外液15-PGDH, PGE2, PGES, sPLA2, cPLA2含量的IC50分别为45,56,40,44,52 g/L,提示桂枝汤生物转化模拟产物对各指标作用由强到弱顺序为PGESsPLA215-PGDHcPLA2PGE2。桂枝汤含药血清各项IC50分别为8.554,8.601,10.575,6.909,10.099 g饮片/kg体重/U,作用由强到弱顺序为sPLA215-PGDHPGE2cPLA2PGES。生物转化模拟产物含药血清各项IC50分别为10.434,10.528,13.207,7.379,11.468 g饮片/kg体重/U,作用由强到弱顺序为sPLA215-PGDHPGE2cPLA2PGES。结果显示,桂枝汤生物转化模拟及其含药血清具有与原方相似的药效。这为进一步探索中药药效物质基础提供了新的方法学启示,也为中药复方剂型改进、发现及创制新型中药提供实验支持。


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