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养阴清肺活血法调控Notch1/Jagged1防治放射性肺纤维化的机制研究

董广通  
【摘要】:1研究背景放射疗法是现代肿瘤治疗的常用手段之一,用于各种恶性肿瘤的治疗中。肺癌、乳腺癌、食管癌、及其他胸部恶性肿瘤常常需要接受胸部放射治疗。肺为辐射敏感器官,邻近肿瘤的肺组织如果接受的放射剂量超过引发其生物效应的阈值,则可产生不同程度的放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury,RILI),主要表现为早期的放射性肺炎(Radiation-induced lung pneumonistis,RIPR)和晚期的放射性肺纤维化(Radiation pulmonary fibrosis,RPF)。后期的纤维化病变一旦发生则病情严重,往往不可逆转,临床以进行性呼吸困难逐渐加重,咳痰咯血,通气功能降低以及影像上双肺弥散性病变等症状为主。加之近年来随着胸部肿瘤疾病发病率逐年增高,接受放疗患者数量增加,肺纤维化病变率也呈上升趋势,而临床对其采用的抗菌或激素疗法无明显效果且易发生不良反应。放射性肺纤维化的发生严重制约着放射治疗的照射剂量,从而影响了清除恶性肿瘤组织的疗效,因此如何防治放射性肺纤维化的发生已成为急需解决的医学难题之。Notch信号是一类级度保守的信号通路,调控等多种生物细胞的发育。目前在哺乳动物中已鉴定出四种Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4),五种Notch配体(Delta-likel、3、4及Jagged1、2)和转录抑制因子CSL(CBFI/Suppresor of Hairless/Lagl)及其他的效应物。其通路激活形式为经典的“三步酶切反应”:当Notch信号在细胞膜表面的配体与邻近细胞的膜外Notch受体彼此连接后,Notch受体被激活,随之它的跨膜区依次在ADAM金属蛋白酶(ADAM17、ADAM10)和γ-Secretase下从跨膜区蛋白裂解位点S3裂解,进而在胞内段释放 NICD(Notch intraCellular domain),NICD 为 Notch 信号在胞内的活化形式。释放的胞内区可直接转入细胞核内而不经与其它信号传导分子的作用,并通过其MAM结构域与转录因子CSL相互作用,使CSL由转录抑制因子转变为转录激活因子,从而使Hesl、Deltex-1、Heyl等下游基因被激活,起到调控细胞增殖和分化的目的。随着研究的不断深入,越来越多的文献报道发现Notch信号的活化与放射性纤维化的发生发展密切相关,通过与多种细胞因子和信号通路的相互作用加重RPF的进程。因此通过干预Notch信号的上游或下游基因从而抑制Notch信号的活化可能成为治疗RPF的潜在机制。通过近几年的研究发现,中医药在防治放射性肺纤维化的过程中取得了较为不错的效果,对于肺部间质性疾病具有一定的治疗优势,且安全性高,毒副作用小。中医认为电离辐射属于火毒之邪,伤津耗气,而肺为娇脏,易于染邪而发病。本病的病理性质为本虚标实,阴虚、血虚为本,热毒、痰热、瘀血为标,往往相互夹杂,病机复杂多变。中国中医科学院广安门医院肿瘤科侯炜主任基于肿瘤患者正虚邪实的体质特点,在扶正培本、固本清源的治则下采用养阴清热,益气活血之法治疗放射性肺损伤,在临床中已取得不错效果。本研究以RPF模型大鼠局部肺组织及外周血T细胞为研究对象,围绕与RILI密切相关的Notch信号通路为着眼点,对侯炜主任经验方“养阴清肺活血”方的治疗作用机制进行试探性研究。本研究主要分为两部分,第一部分为文献研究,系统综述了放射性肺纤维化的中西医研究概况,放射性肺纤维化是西医病名,主要由累计放射剂量超过肺泡细胞耐受剂量而产生,发病机制多样,目前较为公认的为“细胞因子瀑布学说”,其形成过程大概分为肺泡免疫炎性反应、肺实质损伤、纤维化形成三个阶段。中医学中并无纤维化病名,相关论述散在记载于“咳嗽”、“肺痿”、“肺胀”、“肺痹”等证。多因虚起病,肺肾亏损,痰瘀互结,虚实夹杂,历代医家根据其演变特点辨证分期、分型论治,屡获不错效果。Notch信号通路是近期发现与纤维化密切相关的通路,通过参与多种生物体内炎性反应、免疫反应、氧化应激等途径影响纤维化进程。故本研究将从Notch信号通路的角度探求中医药防治RPF的作用机制。第二部分为实验研究,通过建立RPF大鼠模型,采用“养阴性肺活血”经验方,运用病理、免疫组化、流式细胞术等研究方法,从Notch角度观察养阴清肺活血方对RPF大鼠病理形态、Notch受体与配体在组织及免疫细胞中的表达。结果表明,养阴清肺活血方能够有效改善大鼠炎症及纤维化程度,其作用机制可能是通过下调Notch信号上游受体配体实现的。提示该方可通过干预调控Notch信号防治放射性肺纤维化。总之,笔者从文献和实验两个方面对中药养阴清肺活血方防治RPF进行相关探讨,并初步阐明干预Notch信号通路的作用机制。其研究结果不仅希望为中医药防治放射性肺纤维化提供理论依据,也为今后进一步的研究提供了思路。2研究目的通过观察养阴清肺活血方对放射性肺纤维化大鼠一般情况、肺组织病理形态、肺脏指数、局部肺组织及外周血T细胞中Notchl、Jaggedl调节的影响,探讨该方对放射性肺纤维化病变的治疗机制,为临床用药提供理论依据。3研究方法3.1放射性肺纤维化大鼠模型的建立大鼠常规饲养1周后称重,将大鼠用10%的水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,仰卧位固定于自备木架,充分暴露胸部,6MV-X线加速器单次全胸照射16 Gy,照射范围上至两腋窝、下至胸骨剑突(约为3.0 cmX4.5 cm),源靶距为100 cm,剂量率250 cGy/min,在相对较短时间内建立大鼠模型,空白组大鼠在同等条件下肺部假照射0 Gy。3.2动物给药方案各组于照射后第1天开始灌胃给药,逐日1次,持续至取材。每周固定时间称重一次并按体重变动调整灌胃剂量,按1ml/100g药量给药。空白组:生理盐水,1次/d灌胃;模型组:生理盐水,1次/d灌胃;激素组:1-2周1.25mg/(kg · d)醋酸泼尼松注龙射液腹腔注射,第3周0.625 mg/(kg · d)醋酸泼尼松注龙射液腹腔注射,5-8周生理盐水;中药组:1-4周肺炎期中药9.7 g/(kg·d)中药药液,1次/d灌胃,5-8周时改为纤维化期中药9.7g/(kg·d),1次/日灌胃;联合用药组:1-2周肺炎期中药+激素药液(9.7 g中药+1.25 mg泼尼松龙注射液/(kg ·d),1次/d灌胃或者腹腔注射;3周改为中药+激素药液(9.7 g中药+0.625 mg泼尼松龙注射液/(kg ·d)),1次/d灌胃或者腹腔注射;5-8周时改为纤维化期中药(9.7 g/(kg·d)),1次/d灌胃。3.3肺组织病理观察及指标检测灌胃8周后取材,观察大鼠一般活动情况;收集肺脏组织检测肺脏系数并行HE、Masson染色,光镜下观察病理形态学变化;根据Szapiel等的半定量方法确定其分级情况,免疫组化检测肺组织Notchl表达含量。应用Image Pro-Plus6.0软件计算图片中黄色区域的累积光密度和黄色区域的面积。平均光密度=IOD(Sum)/Area(Sum)。3.4 T细胞Notch信号上游分子的表达。3.4.1腹主动脉采血,免疫磁珠分选提取外周血T细胞。3.4.2采用流式细胞术检测外周血T细胞Notch1受体表达。3.4.3通过RT-PCR技术检测T细胞中Notch1、Jagged1的表达。3.4.4应用Western blot技术检测T细胞中Notch1、NICD、Jagged1的表达。4研究结果4.1 一般情况观察联合用药组大鼠与其他造模组比较,精神状态、体重、以及皮毛、大便等一般情况较好。模型组大鼠死亡3只,照射部位毛色晦暗、质地枯槁、甚至脱落,大便稀溏臭秽,甚至开始脱毛以及皮肤溃烂。与模型组相比,联合用药组病变较轻微。中药组整体情况较激素组稍好,大便干硬或稀溏症状出现较晚,症状也较轻。4.2肺脏肉眼观察及肺系数检测中药组、联合用药组与模型组比较,大鼠肺脏外观组织肿胀溃烂程度较轻,颜色较浅。空白组大鼠肺湿重改变不明显,中药组及联合用药组体重变化不明显,肺湿重略有增加。照射后各组大鼠肺系数与空白组比较均明显增大,差异明显,联合用药组肺系数明显低于模型组,下降趋势明显,与模型组相比,中药组、联合用药组肺系数降低,联合用药组更为明显,激素组肺系数则无明显统计学差异。4.3病理学观察染色后,空白组大鼠肺组织结构清晰,易于识别,支气管壁完整,平滑肌厚度正常,未见炎性细胞等病理变化。照射后大鼠表现出不同水平炎性病变,肺泡壁增厚,炎性渗出水肿明显,支气管壁增厚,毛细血管及肺间质充血,肺间质及肺泡腔内可见大量巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞,并可见纤维样渗出,纤维样结缔组织增生增多,出现实区。给药8周后,中药组、激素组、联合用药组肺组织肿大、出血、渗出等炎性病理改变均比模型组有不同程度的改善,联合用药组除支气管平滑肌厚度不同程度降低外,炎细胞浸润也明显减轻,呈中轻度肺炎改变,优于激素组。4.4指标检测RPF模型大鼠肺组织及外周血T细胞中存在Notch1、Jagged1表达失调的现象,免疫组化结果显示,空白组在主支气管、血管周围、肺间质组织中只看到淡黄色颗粒和条纹,只有极少数深黄色或棕色条纹。照射8周后模型组Notch1明显上调,表达较强,在支气管及肺泡壁周围多见棕黄色条纹及颗粒,Notch1表达量显著高于空白组。流式细胞术也检测到T细胞中Notch1受体组间差异明显,RT-PCR及Western-blot显示中药养阴清肺活血方、糖皮质激素以及两药联合应用可以调节Notch信号受体、配体在细胞核内外的含量。联合用药组较之单药效果较好。研究结论中药养阴清肺活血方可明显改善RPF大鼠肺组织炎症和纤维化水平,有效防止肺纤维化的进程。其作用机制可能与下调Notch1、NICD、Jagged1表达有关,表明该方可通过调节Notch信号通路起到防治作用。


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