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水溶性番茄浓缩物抗血小板聚集效应研究

张倩  
【摘要】:研究目的研究水溶性番茄浓缩物(Water soluble tomato concentrate,WSTC)抗血小板聚集效应。研究背景心血管疾病,特别是血栓性疾病,严重危害人们的生命与健康。血小板的活化和聚集在生理止血过程和血栓形成过程中起着至关重要的作用。生理条件下,血管损伤部位的血小板活化促进止血;然而,动脉粥样硬化斑块破裂或血流紊乱区域的血小板过度活化则可导致血栓形成,诱发急性心肌梗死和缺血性中风等疾病。研究表明糖尿病患者、久坐人群、肥胖和胰岛素抵抗等人群的血小板聚集活性增高或在活化剂作用下表现出过度反应的状态。临床上应用抗血小板药物如阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛等对于心脑血管疾病二级防治具有重要意义。然而,抗血小板聚集药物在影响血小板功能的同时也会伴随出血时间延长的现象,这对于心血管风险相对较低人群的一级预防可能并不适合。因此,寻找更安全的抗血小板物质从而抑制血小板过度活化,对于预防心血管疾病具有非常重要的意义。番茄(Lycopersicon esculentum)含有多种有益于人体健康的成分,包括维生素E、类黄酮、植物甾醇、类胡萝卜素、多种水溶性维生素和矿物质等多种对人体有益的成分。WSTC是从成熟的番茄中提取而得,含有核苷类、酚类和黄酮类等成分。国外临床试验研究表明WSTC可影响人血小板活性,抑制血小板聚集,但其抗血小板聚集的分子机制尚不清楚。本研究采用激光比浊法,分别探究体外血小板孵育WSTC以及动物口服WSTC后对血小板聚集的影响;采用普利生半自动血凝仪C2000,考察WSTC对正常大鼠凝血功能的影响;以Calcein AM荧光标记血小板,通过血小板与纤维蛋白原结合实验,研究WSTC对血小板GPⅡb/Ⅲa的活化作用;采用Western blot法研究WSTC对血小板PI3K、PDI、PECAM-1及骨架蛋白β1-tubulin表达影响,探究WSTC抑制血小板聚集可能的作用机制。研究内容1.WSTC体外抗大鼠血小板聚集研究雄性SD大鼠,戊巴比妥钠(50mg·kg-1)麻醉,腹主动脉取血,梯度离心分离制备PRP(Platelet Rich Plasma,富血小板血浆),将PRP分别与不同浓度的WSTC(0.06 g.L-1、0.60g·L-1、6.00 g·L-1)体外 37℃孵育 5 min,以 ADP(Adenosine diphosphate,二磷酸腺苷,2.5 μmol·L-1诱导血小板聚集。采用比浊法,通过血小板聚集仪测定血小板的最大聚集率。2.WSTC半体外抗大鼠血小板聚集研究55只雄性SD大鼠随机分为5组,分别为正常组,氯吡格雷组(7.5 mg·Kg-1),WSTC低剂量组(25 mg-Kg-1),WSTC中剂量组(75 mg·Kg-1)和WSTC高剂量组(150 mg·Kg-1),每组按照1 mL·100g-1大鼠体重灌胃给药/蒸馏水,每日1次,连续给药4周。末次给药2 h后麻醉取血,分离制备PRP,在ADP(2.5 μmol·L-1)诱导下,利用血小板聚集仪测定血小板最大聚集率。3.WSTC对正常大鼠凝血功能影响的研究55只雄性SD大鼠随机分为5组,分别为正常组,ASA组(Aspirin,阿司匹林,7.5mg·Kg-1),WSTC 低剂量组(150 mg·Kg-1),WSTC 中剂量组(30mg·Kg-1)和WSTC高剂量组(900mg·Kg-1),每组按照2mL 1OOg-1大鼠体重灌胃给药/蒸馏水,每日1次,连续给药7天。末次给药2h后取血,制备血浆,通过半自动凝血仪测定FIB(Fibrinogen,纤维蛋白原分子)含量、TT(Thrombin time,凝血酶时间)、PT(Prothrombin time,凝血酶原时间)以及 APTT(Activated partial thromboplastin time,活化部分凝血酶时间)。4.WSTC对血小板GP Ⅱb/Ⅲa活化影响的研究在黑色96孔培养板内加入纤维蛋白原溶液(250 μμg mL-1)100μL,于4℃C包被过夜,实验前用含1%BSA(Bull Serum Albumin,牛血清白蛋白)的HEPES-TYRODE(无Ca2+)缓冲液100 μL于37℃孵育1 h,封闭以消除非特异性黏附配体。正常大鼠取血后分离制备洗涤血小板,将洗涤血小板与CalceinAM(4μmol·L-1)室温下避光孵育1 h进行荧光标记。荧光标记血小板与不同浓度WSTC(0.06 g·L-1、0.6 g L-1、6.00g·L-1)体外37℃避光孵育10min后,在ADP(10μmol·L-1)诱导下,与纤维蛋白原进行结合反应15 min后,洗去未结合的血小板;采用荧光酶标仪测定血小板荧光强度,进而反映对GPⅡb/Ⅲa活化的影响。5.WSTC对血小板PI3K、PDI、PECAM-1和β1-tubulin表达影响的研究正常大鼠取血后分离制备洗涤血小板,将洗涤血小板与不同浓度WSTC(0.06g·L-1、0.60 g·L-1、6.00 g·L-1)体外37℃孵育5 min后,在ADP(10mol·L-1)诱导下,刺激活化血小板5 min,离心后裂解血小板,提取血小板总蛋白,用Western blot法检测 PI3K p110β、PDI、PECAM-1 和 β1-tubulin 的表达。实验结果1.体外孵育WSTC对大鼠血小板聚集率的影响在ADP(2.5μmol·L-1)诱导下,6.0 g·L-1WSTC对血小板聚集的抑制作用较强(P0.01),平均抑制率为64.07%。WSTC体外抑制ADP诱导血小板聚集的半数抑制浓度(IC50)为3.4 g·L-1。2.大鼠口服WSTC对血小板聚集率的影响WSTC(25mg·Kg-1,75mg·kg-1和150mg·Kg-1)灌胃给药4周后,对ADP(2.5μmol·L-1)诱导的大鼠血小板聚集具有显著的抑制效应。正常组血小板最大聚集率为56.29%,与正常组相比,氯吡格雷组血小板最大聚集率为2.55%,显著抑制血小板的聚集,抑制率为 95.48%(P0.01);25mg·Kg-1,75mg·Kg-1 和 150 mg·Kg-1 的 WSTC组血小板最大聚集率分别为42.55%、44.2%、44.55%,显著抑制血小板的聚集,平均抑制率分别为24.42%、21.48%、20.87%(P0.05)。3.WSTC对正常大鼠凝血功能的影响WSTC(150mg·Kg-1,300mg·Kg-1 和900 mg·Kg-1)灌胃给药 4 周后,对大鼠 FIB含量没有影响,且对PT、TT、APTT也无影响,表明WSTC对大鼠凝血功能无明显影响。4.WSTC对血小板GP Ⅱb/Ⅲa活化的影响在ADP(10μmol·L-1)的诱导下,模型组血小板与纤维蛋白原结合率显著上升,表明血小板GP Ⅱb/Ⅲa活化,且活化率为52.65%(P0.01);与模型组相比,0.60 g·L-1和6.00g·L-1 WSTC可明显降低血小板与纤维蛋白原结合率,显著抑制GPⅡb/Ⅲa活化,抑制率分别为17.47%和32.29%。5.WSTC 对血小板 PI3K、PDI、PECAM-1 和 β1-tubulin 表达的影响在 ADP(10μmol·L-1)诱导下,0.06g·L-1、0.60g·L-1、6.00g·L-1WSTC 对血小板相关蛋白的表达显示出不同的调节作用。0.60 g·L-1 WSTC可显著下调PI3K p110β的表达,抑制率为61.0%(P0.01);6.00g·L-1WSTC可显著下调PDI的表达,抑制率为 59.0%(P0.05);0.60 g·L-1 和 6.00 g·L-1 WSTC 可显著下调 PECAM-1 表达,抑制率分别为 26.0%和 38.0%(P0.05);0.60 g·L-1 和 6.00 g·L-1 WSTC 可显著上调血小板骨架蛋白β1-tubulin表达,增长率均为36.0%(P0.01)。结论1.WSTC体外抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集;2.WSTC灌胃给药可抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集,且不影响其凝血功能;3.WSTC通过抑制GP Ⅱb/Ⅲa的活化抑制血小板聚集;4.WSTC抑制血小板聚集的作用机制与调控PI3K p110β/PDI/PECAM-1相关信号通路,稳定细胞骨架有关。


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