失眠症状群及其方证相应的分子网络关联机制研究

【摘要】：研究目的从“疾病-症状群表型网络-中药靶标网络-分子网络相互关联”的角度,利用失眠临床实际诊疗数据,探索症状群分类方法、有效核心方发现方法和失眠症状群的分子网络关联机制等研究,以阐释“病-证-治-效”(方证相应)的科学内涵,为中医药领域开展相关研究提供方法学参考。研究方法(1)失眠临床实际诊疗数据中有效病例数据判断方法:应用已有的结构化失眠临床诊疗数据,采用统一的疗效评价标准与质量控制方法,对多个医师队列的失眠患者人群特点进行分析与疗效评价,并采用倾向性评分匹配的方法消除年龄、病程、文化程度、合并疗法等混杂因素得到了均衡的有效病例样本亚群。(2)失眠症状群分类与有效核心方药挖掘方法:采用文本挖掘方法对失眠有效病例的刻下症和辨证论治清单进行处理,提取高质量规范化症状谱,再将高频症状导入孔明灯软件进行隐结构分析,探究失眠症状群分类及辨识规则。采用Gephi软件对处方进行社区划分,然后用复杂网络分析软件Liquorice中的层次核心结构网络提取算法挖掘有效核心方药;采用比值比和卡方检验统计分析方法,判断有效核心方药与症状群的对应情况。(3)失眠症状群与有效核心方药网络药理学分析方法:参照UMLS进行相关术语规范,然后整合生物医学数据库中失眠疾病基因、症状基因、中药-化合物-靶标,再导入STRING平台中构建PPI网络,采用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化展示和拓扑结构分析,并在DAVID平台对网络模块中的Hub节点进行KEGG和GO功能富集分析,确定其主要的功能特征。并对数据挖掘结果进行初步验证,验证方法有:①症状群-基因、有效核心方药-靶标与失眠西药靶标取交集;②有效核心方药-靶标映射失眠西药作用通路;③失眠症状群-基因网络与有效核心方药-靶标网络,二者的Hub节点富集的KEGG通路取交集。共3种方式对症状群-有效核心方药的分子网络关联机制进行初步验证。(4)失眠症状群差异基因分析方法:采用转录组高通量测序分析,分析具有失眠典型症状群的患者与健康人群的基因差异性表达情况;采用cluster Profiler对差异基因进行KEGG和GO功能富集分析,探索失眠症不同症状群的分子网络关联机制是否一致,并采用转录组测序分析结果与网络药理学数据挖掘结果相互佐证的方式进行双重验证。研究结果(1)多个医师队列失眠患者人群特点分析与疗效评价:分析各个医师队列失眠患者基线特征(性别、失眠症状特点、伴随焦虑与抑郁情况等),结果9个队列共有994例患者,2697诊次数据。失眠患者均呈现出性别的差异,为女性多于男性,多见于脑力劳动群体,文化程度以中、高级居多,多数人居住情况为同住。失眠患者普遍存在不同程度的焦虑和抑郁的情绪问题,日间功能均有不同程度的受损。按照治疗前后PSQI与SE的改善情况制定疗效评价标准,结果显示医师Ⅰ队列的有效率最高为91.9%,其次是医师H为63.5%、医师F为62.4%和医师D为62.1%,共有500例有效病例与471例无效病例,经倾向性评分1:1匹配后得到了相匹配的340个疗效有效和340个疗效无效的样本亚群。(2)失眠症状群分类与有效核心方药发现研究:通过对失眠有效病例的症状群分类和相应有效核心处方的挖掘分析,得到失眠常见的5个症状群及其相应的核心方药:①症状群Ⅰ(反映心脾两虚病机):眩晕、纳少、嗳气、心悸、神疲乏力等,相应核心方药为黄芪、当归、白芍、百合、酸枣仁等。②症状群Ⅱ(反映肝郁化火病机):神疲乏力、烦躁易怒、头重、头痛、小便黄等,相应核心方药为香附、栀子、郁金、黄芩、珍珠母等。③症状群Ⅲ(反映心肾不交病机):眩晕、腰膝酸软、口干、耳鸣等,相应核心方药为百合、知母、首乌藤、酸枣仁等。④症状群Ⅳ(反映血瘀病机):头晕、舌瘀点瘀斑、心悸、不思饮食、噩梦等,相应核心方药为柴胡、生地、当归、赤芍、牛膝等。⑤症状群V(反映痰热病机):口苦、眩晕、胸闷、痰多、舌红、小便黄等,相应核心方药为黄连、青礞石、法半夏、竹茹、枳实等。(3)失眠症状群-有效核心方药的分子网络关联机制发现研究:通过整合生物医学数据库,构建了含有320个基因的症状群Ⅰ(心脾两虚)-分子网络模块,相应有效核心方-化合物-靶标网络,包含60个化合物和932个靶标;初步验证结果表明:症状群Ⅰ(心脾两虚)与相应有效核心方药,相同靶标为33个、共同通路为95个;症状群Ⅰ(心脾两虚)-有效核心方药与失眠西药,共同靶标有9个;症状群Ⅰ(心脾两虚)-有效核心方药主要作用于GABA能突触,苯丙氨酸代谢通路,酪氨酸代谢通路。症状群Ⅱ(肝郁化火)-分子网络模块包含基因430个,相应有效核心方药-化合物-靶标网络,包含化合物124个,靶标1221个;初步验证结果表明:症状群Ⅱ(肝郁化火)与相应有效核心方药相同靶标为32个、共同通路108个;症状群Ⅱ(肝郁化火)-有效核心方药与失眠西药,共同靶标有16个;症状群Ⅱ(肝郁化火)-有效核心方药主要作用于5-羟色胺能突触,亚油酸代谢,色氨酸代谢通路。(4)失眠症状群小样本健康对照的转录组测序分析研究:共纳入健康对照者22例,症状群Ⅰ(心脾两虚)患者21例,症状群Ⅱ(肝郁化火)患者11例进行转录组测序分析。分析获得症状群Ⅰ(心脾两虚)独有的差异基因为67个,其GO terms主要涉及水和电解质的跨膜转运、骨骼肌的发育及氨基酸代谢过程等,KEGG通路主要涉及昼夜节律夹带,脂肪与蛋白质等营养物质消化吸收,血小板活化及唾液与胰岛素的分泌调节等。症状群Ⅱ(肝郁化火)独有的差异基因为149个,其GO terms主要涉及细胞分化、性别分化与NOS活性调节等,KEGG主要涉及钙信号通路、昼夜节律、5-羟色胺能突触等通路。(5)转录组测序分析与网络药理学数据挖掘结果相互佐证:症状群Ⅰ(心脾两虚)差异基因集与数据挖掘基因集取交集,共有基因为7个。症状群Ⅰ(心脾两虚)-有效核心方药中的黄芪、当归、酸枣仁、白芍等11味中药,包含的黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)、阿魏酸(ferulicacid)、枣苷 A(Jujuboside A)、芍药苷(paeoniflorin)等 17 种化合物,映射了症状群Ⅰ(心脾两虚)的9个差异基因。症状群Ⅰ(心脾两虚)差异基因与数据挖掘基因的Hub节点富集的KEGG通路取交集,共同通路为72条。症状群Ⅱ(肝郁化火)差异基因集与数据挖掘基因集取交集,共有基因为8个。症状群Ⅱ(肝郁化火)-有效核心方药中的黄芩、栀子、酸枣仁、珍珠母、香附等13味中药,包含的黄芩苷(Baicalein)、栀子甙(geniposide)、枣苷A(JujubosideA)、香附酮(Cyperolone)等43种化合物,映射了症状群Ⅱ(肝郁化火)28个差异基因。症状群Ⅱ(肝郁化火)差异基因与数据挖掘基因的Hub节点富集的KEGG通路取交集,共同通路为54条。研究结论本研究突破了传统的证候分子生物学机制研究思路,借鉴《伤寒论》“方证相应”思想,引入国际通用的症状群概念,采用相对固定和高度概括的症状群,将证候进一步客观化;并利用网络药理学方法和临床转录组测序分析相互佐证的方式,构建了探索症状群与相应核心方药分子网络关联机制的方法,为开展阐释病-证-治-效(方证相应)科学内涵的研究,奠定了方法学基础:(1)基于失眠真实世界临床诊疗数据,严格按照疾病公认的疗效评价标准,筛选出有效病例数据,并采用倾向性评分匹配方法消除混杂因素,可为分析挖掘医师有效核心处方和症状群的特点提供方法学。(2)症状群分类是实现症状群-有效核心方药分子网络机制研究的关键环节,隐结构分析法可较好地实现失眠症状群的分类,为症状群的客观性和稳定性提供了相对成熟的模型和算法。(3)采用网络药理学方法建立中医症状群-基因关联关系的研究方法,突破了目前中医症状群与基因缺少对应关系的瓶颈,结合临床转录组测序分析相互佐证的方法,证实了失眠症状群与相应有效核心方药分子网络相互关联的研究路径基本可行。(4)本研究初步发现失眠不同的症状群,具有不同的分子网络关联机制,相关分子网络的改变与脏腑的生理病理功能有关,一定程度上能够阐释中医病机的科学内涵;表明以相对固定的症状群及其分子网络关联机制结合“病机”指导辨证论治的探索,是“病-证-治-效”相互关联研究思路的进一步深化。