补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响

【摘要】：椎间盘源性腰痛(Discogenic lowback pain,DLBP)作为一种临床常见的腰椎间盘退行性疾病,多由椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IDD)引起,以“腰痛”为主要临床症状,一般无神经组织受压表现。近年来,随着科学技术的进步,尤其是磁共振影像技术的广泛应用,人们对DLBP的诊断和治疗方面取得了巨大进展。目前临床治疗DLBP主要包括西药、手术等疗法。尽管具体治疗方式多种多样,短期内疗效显著,但缺乏显著特异性,且主要停留在对症治疗层面,未对产生症状的病变椎间盘本身进行干预,复发率较高。中医学认为DLBP属于“腰痛”的范畴,且在治疗此类慢性脊柱骨伤科疾病方面积累了丰富的临床经验。课题组前期通过小样本的临床观察发现,将古方青娥丸化裁而来的补肾活血方应用到DLBP的治疗,能够减轻患者的疼痛,改善腰椎活动功能,提高患者的生存质量。但是,目前我们仍缺乏高等级的循证学临床研究,且评价指标仅限于主观指标,也未进行药物安全性评定;同时该方治疗DLBP的具体调控机制仍缺乏基础研究进一步阐释。因此,本项目在课题组前期研究的基础上,首先应用平行、双盲、随机、安慰剂对照的试验设计,进一步采用公认主观评分结合客观评价的方法,以期更加全面的评定补肾活血方治疗DLBP的临床疗效及安全性。然后采用HE染色、Masson染色、免疫组织化学分析等以观察药物对兔退变椎间盘组织结构形态及MMP-3、VEGF等相关蛋白表达的影响。最后采用MTT、免疫荧光技术、蛋白质印迹法、β-半乳糖苷酶染色等技术观察药物对IL-1β或H2O2诱导的人髓核细胞外基质内相关蛋白表达水平的影响。旨在从分子细胞水平探究补肾活血方调控椎间盘髓核细胞活性与功能延缓或抑制IDD进程的作用机制,也为下一步补肾活血中药延缓IDD的机理研究提供新思路。研究一补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床疗效及安全性目的:评价补肾活血方治疗DLBP的临床疗效及安全性,为进一步临床应用推广提供高等级的循证医学依据。方法:本研究严格按照纳入、排除标准,共纳入来自于我院脊柱骨科、骨伤综合科门诊的DLBP患者70例。应用平行、双盲、随机、安慰剂对照的试验设计方法,其中治疗组35例,对照组35例,以腰椎牵引为基础疗法,治疗组服用补肾活血方颗粒剂,对照组服用补肾活血方安慰剂,总疗程为3周,随访期3个月。分别于入组时,治疗后7、14、21天,及疗程结束后1个月与3个月随访,共六个时间点对比观察两组患者的VAS评分、ODI评分,与肌肉软组织张力位移、腰部压痛阈值、腰椎活动度,以及实验室检查、不良反应等指标,并记录分析相关临床试验数据。结果:两组患者在性别(P=0.208)、年龄(P=0.363)、病变节段(P=0.771)、病程(P=0.781)等方面的差异无统计学意义(P0.05),一般资料具有可比性。相关结局评价指标比较结果如下:(1)VAS评分方面:①与治疗前比较,两组患者在治疗后至随访时均有统计学意义(P0.05);②与治疗前及治疗1周时比较,治疗组在治疗2周后及随访时差异均有统计学意义(P0.05);③两组间比较治疗2周后至随访时治疗组较对照组均有显著差异(P0.05)。(2)ODI评分方面:①对照组患者治疗3周后至随访时较治疗前差异有统计学意义(P0.05),随访1月时较治疗1周后也有明显差异(P0.05),随访3月时较治疗1周后与2周后有显著差异(P0.05);②治疗组患者治疗1周后较治疗前就有差异(P0.05),治疗2周至随访时与治疗前及治疗1周时相比,时间效应均有统计学意义(P0.05);③两组间比较治疗2周后至随访1月时治疗组较对照组均有显著差异(P0.05)。(3)软组织张力位移方面:①较治疗前相比,治疗3周后两组患者的张力位移均显著增加(P0.05);②两组间比较治疗组较对照组位移增加显著(P0.05)。(4)腰部压痛阈值方面:①治疗3周后,两组患者的腰部压痛阈值较治疗前均显著增加(P0.05);②两组间比较治疗组较对照组阈值增加显著(P0.05)。(5)腰椎活动度方面:①对照组患者治疗3周后与治疗前相比,腰椎左侧屈度数显著增加(P0.05);②治疗组患者治疗3周后前屈、后伸、左侧屈、右侧屈角度较治疗前均显著增加(P0.05)。(6)临床治疗效果方面:经补肾活血方治疗1,2,3周后总有效率分别为47.06%,61.76%,70.59%,表现出优于对照组的趋势。(7)安全性评价方面:①两组患者在治疗期间一般生命体征均未出现异常;②均未发现与药物有关的不良反应;③实验室及心电图等检查未见异常。结论:补肾活血方对椎间盘源性腰痛患者具有较好的临床疗效,能够显著减轻疼痛程度、改善功能障碍,且安全性较高。研究二补肾活血方对兔退变椎间盘模型的影响目的:应用补肾活血方对实验兔椎间盘退变模型进行干预,观察补肾活血方对IDD进程的影响。方法:40只健康兔随机分为5组,每组8只,分别为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,连续给药8周。采用HE染色、Masson染色等以观察药物对椎间盘组织形态结构的影响;采用免疫组织化学分析药物对MMP-3、VEGF等蛋白表达水平的影响。并记录分析相关动物实验数据。结果:(1)HE染色:正常椎间盘组织可见大量NPCs,ECM的排列均匀。造模后纤维环疏松、紊乱,部分出现断裂,细胞数量减少,指纹样改变突出,裂隙增多。药物干预后,中、高剂量组NPCs数量较低剂量组增多,ECM排列较低剂量组及模型组也更加规则,纤维环断裂减少,其中中剂量组的髓核组织形态更接近对照组。(2)Masson染色:正常椎间盘纤维环结构完整,胶原排列有序,呈现蓝色,NPCs呈现深红色或褐色,细胞质呈现红色,髓核组织与纤维环分界清晰。造模后,纤维环内层出现裂隙,NPCs排列紊乱,细胞变性、凋亡,髓核与纤维环边界模糊,髓核组织逐渐纤维化。中药干预后,胶原纤维含量显著增多,髓核及纤维环之间裂隙减少,且中、高剂量组组织形态明显优于低剂量组。(3)免疫组织化学分析:模型组MMP-3、VEGF蛋白阳性染色率较对照组均明显增加(P0.05),而中、高剂量组MMP-3、VEGF的表达较模型组均显著下调(P0.05)。结论:补肾活血方可下调兔退变椎间盘组织中的MMP-3、VEGF表达水平,其中中剂量组的效应最显著,提示可能在IDD的过程中发挥了作用。研究三补肾活血方对人髓核细胞活性和细胞外基质的影响目的:观察补肾活血方对IL-1β和H2O2诱导的人NPCs活性、功能和ECM分解、代谢的影响。方法:通过培养人原代髓核细胞系,取传代后NPCs备用;按一定比例制备补肾活血方(BSHXF)提取液,向NPCs中加入不同浓度的BSHXF,分别于干预后24 h、48 h对细胞活性进行MTT检测;将研究共分五组,组别及干预方案分别为:①Control 组;②IL-1β组;③H2O2组;④IL-1β+BSHXF 组;⑤H2O2+BSHXF组;分别采用MTT法检测NPCs增殖情况;细胞免疫荧光技术检测Ⅱ型胶原表达情况;WB法检测Collagen Ⅱ、Aggrecan、MMP-3及ADAMTS-5等蛋白表达水平;SA-β-gal染色检测NPCs衰老情况;并记录分析相关细胞实验数据。结果:(1)BSHXF适宜浓度检测:①所有浓度的BSHXF对NPCs均无毒副作用,且5、10、50、100或200μg/ml处理48h后可显著提高NPCs的增殖率(P0.05)。其中100μg/ml处理48h后促细胞活性和增殖作用最显著(P0.01)。(2)MTT法检测细胞增殖情况:①24h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降(P0.01);②48h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降(P0.01);与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高(P0.05);与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高(P0.05);③72h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降(P0.01);与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高(P0.01);与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高(P0.01)。(3)Ⅱ型胶原免疫荧光检测:①与Contrl组相比,其余四组细胞中Ⅱ型胶原表达显著下调;②与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组Ⅱ型胶原表达明显上调;③与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组Ⅱ型胶原表达明显上调。(4)WB检测:CollagenⅡ、Aggrecan蛋白检测结果显示:①与Control组相比:其余四组蛋白表达量显著下调(P0.01);②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显上调(P0.01);③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显上调(P0.01)。MMP-3蛋白检测结果显示:①与Control组相比:其余四组蛋白表达量显著上调(P0.01);②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调(P0.01);③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调(P0.01)。ADAMTS-5蛋白检测结果显示:①与Control组相比:IL-1β组,H2O2组蛋白表达量显著上调(P0.01),而IL-1β+BSHXF组,H2O2+BSHXF组蛋白表达量明显下调(P0.01);②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调(P0.01);③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调(P0.01)。(5)细胞衰老情况:①与Contrl组相比,其余四组细胞衰老数量明显增多(P0.01);②与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞衰老数量明显减少(P0.05);③与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞衰老数量明显减少(P0.01)。结论:(1)不同浓度的补肾活血方均可提高人NPCs活性,促进细胞增殖,100μg/ml浓度是一个较为适宜的实验浓度,可为后续细胞实验提供参照;(2)补肾活血方可以改善人NPCs活性与功能,在一定程度上延缓IL-1β或H2O2刺激诱导的人NPCs衰老或凋亡,为中医药防治IDD提供一种新的思路。