负载大麻二酚纳米胶束的制备及抗乳腺癌作用研究

【摘要】：目的2020年,乳腺癌已经成为全球最常见癌症,在新增癌症病例中占11.7%,对女性的生活质量造成了极大威胁。虽然随着检查手段和治疗手段的进步,乳腺癌患者的死亡率有所下降,但是当前的化疗等治疗手段仍有不足之处,对患者的生存质量往往产生不良影响。大麻二酚是桑科植物大麻的非精神类活性成分,能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、细胞周期阻滞、抗肿瘤细胞侵袭和转移、调节肿瘤微环境、与化疗药物具有协同作用且能够减少化疗药物的毒性。但是大麻二酚在水中的溶解度仅有0.1 μg·mL-1,临床应用多通过口服或口腔粘膜喷雾的方式给药,口服生物利用度低,仅为6%左右,难以达到理想的治疗效果。由于EPR效应,聚合物胶束给药系统具有被动靶向作用,而且能够提高亲脂性药物的水溶性和在体循环时间,从而提高药效。因此,本研究通过合成不同分子量的两嵌段共聚物聚乙二醇-聚己内酯(mPEG2k-PCL2k 和 mPEG5k-PCL5k)和聚乙二醇-聚丙交酯(mPEG2k-PLA2k 和mPEG5k-PLA5k),采用薄膜水化法制备负载大麻二酚的纳米胶束,并对聚合物材料及载药胶束的理化性质进行表征,对大麻二酚游离药及载药胶束体外抗乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞活性、机制及其药代动力学进行评价。方法和结果1.嵌段共聚物mPEG-PLA和mPEG-PCL的合成和表征以聚乙二醇单甲醚(mPEG)为引发剂,与D,L-LA或ε-CL发生开环聚合反应,通过调整mPEG的分子量以及mPEG和D,L-LA或ε-CL的质量比,获得不同分子量的嵌段共聚物mPEG2k-PCL2k、mPEG5k-PCL5k、mPEG2k-PLA2k 和mPEG5k-PLA5k。利用1H-NMR确认产物的结构和分子量,利用芘荧光探针法测定各聚合物的临界胶束浓度,透射电镜和激光粒度仪分别表征聚合物胶束的形貌、粒径和电位。结果显示,合成的聚合物材料分子量符合预期,mPEG2k-PCL2k、mPEG5k-PCL5k、mPEG2k-PLA2k和mPEG5k-PLA5k 的 CMC 值分别为 1.12μg·mL-1、1.27 μg·mL-1、1.95 μg·mL-1、0.87 μg·mL-1。各聚合物在水中形成的胶束为类球形,粒径在10-100 nm之间,均带负电荷。结果表明,合成聚合物的方法稳定可控,在水溶液中形成的胶束粒度符合纳米胶束的定义。2.负载大麻二酚纳米胶束的制备和表征利用薄膜水化法制备负载大麻二酚的纳米胶束,利用透射电镜和激光粒度仪对载药胶束的形貌和粒径进行测定,并考察其在室温及37℃条件下的稳定性;利用超高效液相法测定胶束的载药量和包封率;用透析法考察了载药胶束的体外释放性能。结果显示,载药胶束粒径分布均匀,投药量10mg以下的各载药胶束与空白胶束的粒径相比,有所增大;各种条件下,CBD载药胶束的粒径都非常稳定,7天内没有明显变化;除mPEG2k-PLA2k外,各聚合物对大麻二酚的包封率均在90%以上。体外释放结果表明,mPEG2k-PLA2k-CBD、mPEG5k-PLA5k-CBD、mPEG2k-PCL2k-CBD、mPEG5k-PCL5k-CBD 胶束在 7 天内分别释放了 35.53%、40.54%、22.43%和24.82%,说明各胶束具有一定的缓释功能。3.负载大麻二酚纳米胶束体内外抗肿瘤活性研究利用香豆素-6作为荧光探针,模拟难溶性药物在聚合物胶束中被MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞摄取的行为,发现聚合物胶束能够增加细胞对难溶性药物的摄取,其中mPEG5k-PLA5k对细胞摄取的影响最大。采用MTT法考察空白胶束及载药胶束对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的细胞毒性。结果显示,各空白胶束在0-1000 μg·mL-1的浓度范围内对细胞活性没有影响,说明本研究合成的材料生物相容性好;各载药胶束能够抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖,在一定程度上降低了 IC50值,说明药物被胶束包载后能增强其体外抗肿瘤活性。利用MDA-MB-231细胞构建荷瘤小鼠模型,比较游离药及载药胶束对小鼠体内肿瘤增殖和小鼠体重的影响。结果显示,相比空白组和游离药组,胶束mPEG2k-PLA2k-CBD抑制肿瘤增殖作用更强,且对小鼠体重没有显著影响。4.负载大麻二酚纳米胶束抗乳腺癌作用机制研究采用JC-1作为荧光探针检测线粒体膜电位的变化,通过蛋白质印迹法检测CBD和载药胶束对细胞自噬相关蛋白的表达水平。结果表明,纳米胶束更能够促进线粒体膜电位的下降,抑制蛋白Bcl-2和mTOR的表达,促进Beclin 1、LC3B-Ⅱ的表达,从而促进细胞自噬。5.负载大麻二酚纳米胶束药代动力学研究建立了大鼠血浆中大麻二酚的UHPLC-QqQ-MS分析方法,方法专属性好、线性、精密度、回收率良好。考察了尾静脉注射CBD及载药胶束在大鼠体内血药浓度,绘制药时曲线并计算药代动力学参数。结果显示,相比于游离大麻二酚,载大麻二酚的纳米胶束mPEG2k-PLA2k-CBD药时曲线下面积(AUC(0-t)增加,平均驻留时间(MRT)增加,清除率(CLz)降低,说明CBD载药胶束能够延长大麻二酚的在体循环时间,减慢药物从体内清除速度。