TAZ活化强直性脊柱炎Th17细胞及雷公藤甲素干预机制

【摘要】：背景:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是临床常见的炎症性脊柱关节病,以骶髂关节和脊柱附着点慢性炎症为主要特点,也可累及外周关节,常伴有不同程度的全身多系统损伤。本病常累及脑、体力劳动处于最佳状态的青年男性,晚期出现脊柱强直畸形,严重降低患者的生活质量。炎症是AS病理变化的始动环节,炎症一旦发生,将引起AS患者病理性新骨形成,使病理改变进入不可逆期,最终致残。因此,控制炎症是AS治疗的重点。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)由多潜能CD4+T细胞分化而来,能够通过大量分泌细胞因子白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)而发挥致炎作用。Th17/IL-17炎症轴在驱动AS炎症发生中发挥着重要作用。抑制致炎性Th17的分化,成为AS的关键治疗靶标。TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)是Th17细胞的关键转录共激活因子。初始CD4+T细胞经抗原刺激后,活化、扩展并向 Th1、Th2、Th17 及调节性 T 细胞(regulatory T cell,Treg)4 种亚群分化,其分化过程受不同的细胞因子及特征性转录因子的调控。不同于Th1、Th2及Treg亚群,维甲酸相关孤儿核受体(retinoid-acid receptor-related orphan receptor γ t,RORγt)是控制Th17细胞分化的特异性转录因子。而转录因子在基因表达过程中无法独自发挥作用,需要协同转录共激活子形成转录复合物,共同调控基因表达。研究表明,转录共激活因子TAZ能够与RORγt形成转录复合物,增强RORγt转录活性,正向调控致炎性Th17的分化。因此,探索TAZ在强直性脊柱炎患者中的表达及其对AS患者Th17分化的影响,对于寻找缓解和控制AS炎症的新的治疗靶点具有重要意义。AS发病以肾督空虚为本,风、寒、湿、热外邪痹阻经络关节为标。其中,湿热痹阻为AS临床常见证型,治疗当以利湿清热为法。中药雷公藤系卫矛科雷公藤属植物雷公藤的根、叶、花及果实部分,功擅祛风除湿、清热活血、通络止痛。因具有强大的抗炎及免疫抑制作用,雷公藤及其制剂在炎症性疾病及自身免疫病的治疗中得到了广泛运用。网络药理学研究表明,雷公藤有效成分能够通过Th17分化通路发挥治疗AS的作用。雷公藤甲素是雷公藤主要有效活性成分之一。本课题组前期研究表明,雷公藤甲素能够有效干预AS患者外周血中Th17的分化及IL-17的分泌。基于以上研究,本研究将继续着眼于致炎性Th17细胞的分化,探索TAZ在AS患者中的表达及雷公藤甲素干预作用。目的:探索转录共激活因子TAZ在AS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的表达及对于Th17细胞分化调控的影响,并使用中药单体雷公藤甲素体外干预活动期AS患者PBMC,探索雷公藤甲素对活动期AS患者ROR γ t及TAZ表达水平的影响。以期为寻找AS新的治疗靶点及新药研发提供新方向。方法:研究一纳入AS患者共50例,其中活动期AS患者(AS-Active)25例,稳定期AS患者(AS-Stable)25例;健康对照组(Normal)20例。取各组受试者肘窝静脉血后,运用Ficoll-hypaque密度梯度离心法分别收集血清及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);采用酶联免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测各组血清 IL-17 表达水平;采用蛋白免疫印迹法(western blot,WB)检测各组PBMC中RORγ t及TAZ的蛋白表达水平。同时将TAZ表达水平与ROR γ t表达水平、血清IL-17表达水平及炎症指标ESR、CRP和疾病活动指数BASDAI评分做相关性分析。研究二纳入活动期AS患者25例,中药单体雷公藤甲素体外干预活动期AS患者PBMC,观察雷公藤甲素对ROR γ t及TAZ表达的影响。采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析。所有检验采用双侧检验,计量数据资料以x±s表示,p值0.05时认为差异有统计学意义。组间比较,两组数据均符合正态分布且满足方差齐性者,选用两组独立样本t检验;不符合正态分布或方差齐性者,选用Wilcoxon秩和检验。组内比较,两组数据差值符合正态分布且满足方差齐性者,选用配对样本t检验。多个独立样本不符合正态分布或方差齐性者,选用非参数Kruskal-Wallis H检验。两组计量资料符合正态分布者,采用Pearson相关系数进行相关性分析;不满足正态分布者,采用Spearman做相关性分析。结果:1.活动期AS患者较稳定期AS患者血清IL-17表达水平呈显著升高(p0.05),较正常对照组亦呈显著升高(p0.01);稳定期AS患者血清IL-17表达水平较正常组虽升高,但无统计学意义(p0.05)。2.活动期AS患者ROR γ t蛋白表达较稳定期及健康对照组均呈显著升高(p0.01),稳定期RORγt蛋白表达较健康对照组亦显著升高(p0.01)。3.与健康对照组相比,活动期AS患者TAZ蛋白表达呈显著升高(p0.01);与稳定期相比,活动期AS患者TAZ蛋白表达亦呈显著升高(p0.01)。稳定期AS患者TAZ蛋白表达较健康对照组亦呈显著升高(p0.01)。4.Spearman相关性分析结果显示,TAZ表达水平与ROR γ t表达水平呈显著正相关(r=0.730;p0.01),与 ESR、CRP 呈显著正相关(TAZ—ESR:r=0.603;p=0.0010.05;TAZ—CRP:r=0.416;p=0.0390.05),与血清 IL-17 水平呈显著正相关(r=0.800;p0.01),TAZ表达水平与疾病活动指数BASDAI评分无显著相关性(r=0.353;p=0.0840.05)。5.经中药单体雷公藤甲素体外干预AS患者PBMC后,活动期AS患者PBMC中RORγt蛋白表达较干预前显著降低(p0.01);TAZ蛋白表达较干预前亦呈显著降低(p0.01)。结论:1.TAZ在AS患者PBMC中的表达明显升高,可能通过与ROR γ t形成转录复合物,正向调控致炎性Th17分化从而参与AS发病。2.雷公藤甲素体外干预活动期AS患者的PBMC能够下调ROR γ t及TAZ的表达,其可能是干预AS患者Th17分化,从而缓解炎症的有效治疗药物。