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补肾强脊颗粒对强直性脊柱炎患者临床及外周血CD4~+T细胞AICD影响的实验研究

王海隆  
【摘要】: 强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种以骶髂关节慢性炎症为主的周身性疾病。AS的发病涉及遗传因素、环境因素、免疫因素、感染因素等,发病机制仍未阐明,以中医基础理论为指导的中医药疗法,通过辨证论治,取得了良好的效果,因此,深入探索AS中医诊治规律意义重大。导师冯兴华教授从事中医临床工作四十余年,在治疗AS方面有其独到之处。本论文在对中西医治疗AS的大量文献研究基础之上,对导师治疗AS的的学术经验,用现代科学手段进行了挖掘整理;采用随机、阳性药平行对照、前瞻性研究,利用重复测量分析方法,对补肾活血法立法组方的补肾强脊颗粒治疗AS的疗效进行评价,探索了重复测量分析方法在中医药临床研究中的应用;采用流式细胞技术(FCM)、激光共聚焦显微镜(LSCM)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)等技术,从整体——细胞——基因分子——信号传导等层次,深入探讨补肾强脊颗粒治疗AS的可能作用机制,从一个侧面揭示了中医药治疗强直性脊柱炎的理论依据和导师临床经验的科学内涵。 理论研究 1基于文献分析的当代中医风湿病名家对AS认识 目的:通过当代中医风湿病名家对AS认识的系统分析和总结,对AS的病名、病因病机及治疗方法进行整理。 方法:文献整理、分析。 结果和结论:对于AS的病因,当代中医学者多认为肾虚是该病之根本,本病多由于先天肾气不足,筋骨失养,正虚复感外邪而致;病久则化生痰、瘀、热、毒,致使虚实错杂、寒热相兼、缠绵难愈。治疗上,当代医家多主张分为分型分期进行辨证治疗,证型主要分为虚实两大证候,虚证主要包括肾督亏虚、肝肾两虚等证,实证则主要包括寒湿瘀阻证、湿热瘀滞证、痰瘀痹阻证等。分期则主要分为急性期和缓解期。 2基于数据挖掘的冯兴华教授治疗AS经验继承 目的:借助数据挖掘方法,总结导师冯兴华教授治疗AS的学术经验,为研究名老中医学术经验提供新思路、新方法、新途径。 方法:利用数据挖掘、生物信息学技术,以导师理论为依据,导师使用方药为线索,对导师临床治疗AS的58诊次病例,从多个角度进行分析对比、综合归纳,深入挖掘导师治疗AS的学术经验。 结果和结论:导师认为,AS发病以肾气亏虚为本,风寒、湿热、瘀血痹阻为标,瘀血贯穿本病的始终。风寒湿热之邪,侵袭机体,机体受邪则骨失淖泽,且不能养肝荣筋,血海不足,冲任失调,脊背腰胯之阳失布化,阴失营荣,加之寒凝脉涩,必致筋脉挛急,脊柱僵曲;或因久居湿热之域及饮食不节伤脾蕴湿化热,交结湿热之邪乘虚入侵,湿热蕴结伤骨则痹痛僵曲而不遂。AS是一种慢性疾病,瘀血贯穿本病的始终:肾气亏虚导致血液运行无力,或外感风、寒、湿、热之邪入侵机体,使经脉气血循行不畅,病势缠绵,日久不愈,中医理论认为“久病入络”,可出现瘀血阻滞的表现。 临床研究 目的:对补肾强脊颗粒治疗AS的疗效进行评价,探索重复测量分析方法在中医药临床研究中的应用。 方法:对60例AS肾虚瘀阻证患者进行了12周的随机、阳性药平行对照、前瞻性研究,参照国际AS评价工作组(assessment in AS,ASAS)确立的AS疗效评价因子,利用重复测量设计方法,评价补肾强脊颗粒治疗AS的疗效。 结论如下: ①补肾强脊颗粒治疗AS总有效率83.33%,对照药柳氮磺胺吡啶(SASP)总有效率为76.67%。12周时两组疗效相比并无显著差异,但分析两组疗效随时间变化规律发现,在第4周时两组疗效有显著差异,说明补肾强脊颗粒起效较快。补肾强脊颗粒中医证候总有效率93.33%,SASP组中医证候总有效率为83.33%,两组中医证候疗效间有显著性差异。 ②详细分析各项指标,笔者发现补肾强脊颗粒组对观察指标作用随时间变化的规律很有意义。两组间疼痛夜甚、喜暧畏寒等症状有显著差异,说明补肾强脊颗粒对于AS患者血瘀,肾阳虚表现的症状有明显的改善作用。BASDAI,BASFI,疼痛VAS评分,病人总体VAS评分,晨僵时间、指地距、腰骶痛,腰背痛等指标两组间相比虽无显著差异,但在第4周比较时两组间有显著差异。两组虽都有使ESR、CRP下降的趋势,但无显著差异。 ③本部分试验探索了重复测量分析方法在中医药临床研究中的应用,结果表明重复测量分析方法的效应检验效能较大,能较充分利用多时点数据信息。重复测量分析可以全面描述和分析各个时点的变化以及这种变化是否显著,分析时间变化趋势以及是否受可能因素的影响,从而全面、动态的对临床试验的重复测量数据做出恰当分析和评价。这种分析方法应用于中医临床疗效的分析和评价,合乎中医学“整体观念”和“恒动观念”的对临床治疗及其效果的认识。因此,将重复测量设计与分析方法合理的应用于中药临床试验的临床疗效评价将具有重要的意义。 总体来说,虽然12周结束时两组之间疾病疗效并无显著差异,但补肾强脊颗粒对于证候疗效改善优于SASP,且对大多数症状改善的起效时间多出现在4周,故我们认为补肾强脊颗粒治疗AS的起效时间较SASP快,可迅速缓解AS症状,改善AS的病情。总体来说,虽然12周结束时两组之间疗效并无显著差异,但补肾强脊颗粒起效时间多出现在4周,故我们认为补肾强脊颗粒治疗AS的起效时间较SASP快,可迅速缓解AS症状,改善AS的病情。 实验研究 目的:以AS患者外周血CD4~+T细胞为载体,深入探讨补肾强脊颗粒对AS患者的外周血CD4~+T细胞激活诱导的细胞死亡(activation induced cell death,AICD)的作用机制。 方法:流式细胞技术、激光共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR、ELISA等技术。 结果和结论: ①AS患者与健康志愿者外周血CD4~+T细胞AICD的比较。 通过AS患者与正常人外周血CD4~+T细胞凋亡率的比较,发现AS患者外周血CD4~+T细胞较正常人凋亡缓慢,正是由于这些本该被机体清除的CD4~+T细胞未被清除,进而引起了一系列的免疫反应,加重了AS的病情。 ②补肾强脊颗粒对AS患者CD4~+T细胞AICD的影响。 补肾强脊颗粒可促进AS患者外周血凋亡缓慢的CD4~+T细胞凋亡;可促进AS患者血清中Fas、FasL的蛋白表达、减少Bcl-2的蛋白表达,而对Bax的蛋白表达无明显影响;可促进AS患者外周血CD4~+T淋巴细胞Fas、FasL的mRNA表达,对于Bcl-2和Bax的mRNA表达无明显影响。提示补肾强脊颗粒作用于CD4~+T细胞AICD的途径可能是Fas途径,通过增加促凋亡基因Fas/FasL表达,减少抑凋亡基因Bcl-2表达来实现的。 ③补肾强脊颗粒含药血清对原代培养的AS患者外周血CD4~+T细胞AICD的影响。 细胞增殖实验及LDH活力检测表明:补肾强脊颗粒含药血清可抑制AS患者外周血CD4~+T淋巴细胞增殖且不是通过直接杀伤造成的;补肾强脊颗粒含药血清对Fas、FasL、Bax蛋白表达均有促进作用,其中以中、高剂量可明显促进上述蛋白的表达;对于Bcl-2蛋白表达,则只有中、高剂量可减少其表达;补肾强脊颗粒含药血清可促进AS患者外周血CD4~+T淋巴细胞Fas、FasL的mRNA表达、补肾强脊颗粒含药血清高剂量组可减少抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA表达。补肾强脊颗粒含药血清可促进caspase8和caspase3的活化,证明caspase8、caspase3参与了补肾强脊颗粒对AS患者外周血CD4~+T淋巴细胞AICD的调控过程。补肾强脊颗粒各组均可促进caspase8的表达,而对caspase3表达的促进则需用较高剂量。 ④淫羊藿苷对原代培养的AS患者CD4~+T细胞AICD的影响。 淫羊藿苷单体可使AS患者外周血CD4~+T细胞凋亡率明显增加。淫羊藿苷对促凋亡的Fas蛋白的表达有促进作用,其中以中、高剂量可明显促进上述蛋白的表达,对于抑制凋亡基因Bel-2,则中、高剂量均可减少其蛋白表达。对于FasL、Bax的蛋白表达均有虽也促进作用,但无统计学差异。淫羊藿苷对AS患者的原代培养外周血CD4~+T细胞mRNA表达的实验中,对Fas表达有促进作用,高、中剂量组对Bcl-2表达有抑制作用,对FasL、Bax表达有促进趋势,但无统计学差异。中、高剂量淫羊藿苷单体可促进caspase8和caspase3的活化。淫羊藿苷单体对AS患者外周血CD4~+T淋巴细胞AICD的调控过程主要是通过增加Fas,caspase8和caspase3的表达,减少Bcl-2的表达来实现的。 本研究结果提示,以补肾活血立法组方的补肾强脊颗粒对AS患者通过主要是通过Fas途径增加Fas、FasL的表达,减少Bcl-2的表达,最终达到促进凋亡缓慢的CD4~+T细胞发生AICD,从而调节全身失衡的免疫状态,改善AS的病情。 特色和创新之处 1理论研究 利用数据挖掘、生物信息学技术,以导师临床诊疗典型病例为研究对象,以保留着导师辨证论治特色的连续、动态、结构化的临床数据为基础,以导师理论为依据,以导师使用方药为线索,对导师临床治疗AS的58诊次病例,从多个角度进行分析对比、综合归纳,提取导师辨证特点和遣方用药规律等知识,总结导师辨证经验,揭示其理论内涵,初步展现导师学术经验和学术思想,为研究名老中医学术经验继承提供新思路、新方法、新途径。 2临床研究 通过采用重复测量设计方法,参照ASAS工作组的评价标准,对补肾强脊颗粒治疗AS的临床疗效作出客观评价,并参照《中药新药临床研究指导原则》,对补肾强脊颗粒治疗AS肾虚瘀阻证的中医证候改善情况进行总体评价。本部分研究体现了“动态分析”的思想,为深入客观的评价中医药治疗疾病的作用作出有益的探索,是本研究的方法学特色。 3实验研究 AICD是淋巴细胞凋亡的一种特有方式,淋巴细胞AICD功能的异常及消失都将导致自身免疫性疾病的产生,有关AS患者CD4~+T细胞AICD的研究较少,本研究首次从现代细胞分子生物学角度探讨AS患者CD4~+T细胞AICD的发生机制及补肾强脊颗粒对AS患者外周血CD4~+T细胞AICD的影响,国内外未见类似报道。 4理论创新 本课题针对AS治疗的研究热点,提出“补肾活血立法组方的有效制剂补肾强脊颗粒可促进强直性脊柱炎患者外周血CD4~+T细胞发生AICD”的假说并验证研究假说的客观性,利用现代医学生物信息学及分子生物学先进的技术方法,从多个角度探讨补肾强脊颗粒治疗AS可能的作用机制,提供中医药治疗AS的新思路。使中医理论与前沿技术有机结合,从深层次验证了中医补肾活血理论分子基础的科学内涵,使该经典理论的现代研究从理论到实践达到新的水平。 本课题以中医药对AS的影响为切入点,从CD4~+T细胞的AICD入手,采用数据挖掘、重复测量分析方法、现代分子生物学技术,系统研究了补肾活血立法组方的有效制剂补肾强脊颗粒对AS的影响机制,揭示了AS患者CD4~+T细胞AICD的作用机理及中医药对此作用的影响,探索了AS患者中医药治疗的理论基础及现代分子机制,发现Fas/FasL、Bcl-2/Bax介导的AICD在AS发病中的作用,为AS发病的研究及中医药治疗提供了新思路。


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