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清开灵组分配伍治疗小鼠脑缺血的药理机制比较研究

荆志伟  
【摘要】: 近年来,中药复方药效物质基础及其作用机理研究的方法学,方剂多途径、多靶点发挥整合调节的作用原理,方剂配伍规律内在机制,已成为关键科学问题。 1、目的 比较清开灵4个单一组分和4个不同组分配伍治疗脑缺血小鼠的基因表达和药理作用通路,揭示清开灵组分配伍方的配伍与组分的内在机制。 2、方法 2.1理论研究方法 以方剂配伍系统论的特征为主线,梳理方剂君臣佐使的源流和方剂复杂性特征,结合组学研究的方法学,对清开灵组分配伍方的配伍规律研究的切入点进行探讨。 2.2实验研究方法 脑缺血再灌注模型小鼠每组15只,按照不全析因设计原则,分清开灵4个单一组分组:黄芩苷(BA)、栀子苷(JA)、胆酸(UA)、珍珠母(CM),4个配伍组:黄芩苷+栀子苷(BJ,BA+JA)、栀子苷+胆酸(JU,JA+UA)、黄芩苷+栀子苷+胆酸(BJU,BA+JA+UA)、全组分配伍组(BJUC),3个对照组:尼莫地平对照组(NM)、正常对照(SHAM)、模型组(M)。(1)每组随机抽取3只鼠,再灌注24小时后,取脑制作冠状切片,TTC染色,计算梗死体积百分比;(2)一步法抽提脑组织的总RNA,Cy5/cy3标记,点制芯片检测全基因组表达谱,每组重复实验6-9次;(3)Genespring处理差异表达基因数据,GO原则分类,层次聚类分析和主成分分析处理基因表达谱信息,Pathway studio软件系统探索通路变化;(4)选择8个基因设计引物,进行Real time-PCR验证芯片数据。 3、结果 3.1理论研究结果 根据导师学术思想,认为中药方剂的复杂性在于君、臣、佐、使组方原则有机的组合,具有方剂组成成分的整体效应、方剂组成成分数量的整体涌现、方剂配伍的动态时序的特征。以组分配伍方剂作用到特定疾病模型,然后从“药效-分子药理通路”的角度切入,探索方剂配伍与组分关系的内在机制。 3.2实验研究结果 3.2.1清开灵组分配伍对脑缺血梗塞面积的影响 各治疗组均能减少脑缺血面积,其中栀子苷+胆酸(JU,JA+UA)组、全组分配伍组(BJUC)的梗塞面积低于其他5个治疗组(p<0.01)。 3.2.2清开灵组分配伍干预脑缺血鼠基因表达谱的全局分析 基因表达谱包含1,436个(8.72%)差异表达基因(P<0.05),假阳性率(FDR)<5%,分为12个功能。与模型组相比,各个单一组分和配伍组均不同程度地改变了不同数目的基因表达水平,提示这些基因与各治疗组干预缺血的机制有关。 3.2.3黄芩苷(BA)、栀子苷(JA)及其配伍组(BJ,BA+JA)的综合比较 黄芩苷(BA)、栀子苷(JA)和其配伍组(BJ,BA+JA)的重叠基因分别为23、11个。聚类结果显示,栀子苷(JA)首先和配伍组黄芩苷+栀子苷(BJ,BA+JA)组聚在一起,PCA的结果显示两组在前3个主成分特征向量接近,提示两者对脑缺血基因表达的干预总体上一致。 3.2.4栀子苷(JA)、胆酸(UA)及其配伍组(JU,JA+UA)的综合比较 栀子苷(JA)与胆酸(UA)和其配伍组(JU,JA+UA)的重叠基因分别是21,25、30个。聚类结果显示栀子苷(JA)首先和栀子苷+胆酸(JU,JA+UA)组聚为一类,PCA的结果显示两组在前3个主成分特征向量接近,提示两者对脑缺血基因表达的干预总体上一致。 3.2.5黄芩苷+栀子苷(BJ,BA+JA)、胆酸(UA)、三组分配伍组(BJU)三组的综合比较 黄芩苷+栀子苷(BJ,BA+JA)、胆酸(UA)分别和二者配伍组共同显著调控了23、40个基因。三组聚类分析显示两个配伍组首先聚在一起,然后和胆酸(UA)聚在一起。提示三组分配伍组和两组分配伍组的表达效果相似。PCA的结果显示,前3个主成分中三组的特征向量近似,但三组分配伍的贡献度最大,提示胆酸对黄芩苷+栀子苷的辅助作用。 3.2.6三组分配伍组(BJU)、珍珠母(CM)、全组分配伍组三组的综合比较 黄芩苷+栀子苷+胆酸(BJU,BA+JA+UA)、珍珠母(CM)和全组分配伍组(BJUC)的重叠基因分别为18、14个。聚类分析显示,三组分配伍和全组分配伍组(BJUC)首先聚为一类,PCA结果显示,前4个主成分中三组分配伍和全组分配伍组的特征向量均大于珍珠母组,提示全方优于部分配伍,珍珠母对全组分配伍影响较小。 3.2.7基于相似度计算的通路构建比较清开灵不同组分配伍 全组分配伍组及栀子苷组(JA)、黄芩苷+栀子苷组(BJ,BA+JA)能下调C-fos、Elk-1、LPS水平,激活CREB和MAPK-ERK通路;上调STAT1,下调STAT3,激活JAK-STAT通路(P-value=0.89)。 清开灵全组分配伍、黄芩苷+栀子苷+胆酸(BJU,BA+JA+UA)及栀子苷(JA)能从不同途径抑制NF-KB、ikB转录活性,防止其过表达。 黄芩苷+栀子苷(BJ,BA+JA)、胆酸(UA)两组能上调TIMP-1、下调MMP-9,激活MMPs-ECM通路(P-value=0.96),增加血脑屏障保护作用。 全组分配伍组(BJUC)和栀子苷+胆酸(JU)组能上调上游基因VEGF、β-catenin及其下游蛋白TCF3,激活Wnt-β-catenin通路(P-value=0.92)。 4、结论 4.1清开灵单一组分和组分配伍均可以不同程度地改善脑梗塞面积,起到脑保护的作用。而全组分配伍组的效果明显优于各个单一组分和部分组分配伍组,体现了“君、臣、佐、使”四部分配伍的优势。 4.2栀子苷能发挥和黄芩苷+栀子苷(BJ,BA+JA)、黄芩苷+栀子苷+胆酸(BJU,BA+JA+UA)配伍组相似的药理通路效应,在清开灵4个组分中起主导作用,但仍需与其他三组分配伍使用,达到最佳疗效。 4.3组分配伍组黄芩苷+栀子苷+胆酸(BJU,BA+JA+UA)和全组分配伍组(BJUC)通过激活MAPK、PI3-K/Akt、JAK-STAT、NF-KB、Wnt、TGF-β、Ca2+、IGFlR-CEBPA等多条信号转导通路,整合调节后起到总体上的脑保护作用。 总之,通过对清开灵4个单一组分和4个不同组分配伍治疗小鼠脑缺血后脑缺血面积的比较,运用基因芯片技术构建不同组分配伍差异基因表达谱的比较,运用通路分析技术对构建的基因调控通路的比较,发现全方配伍改善局部脑缺血的疗效优于不全组分配伍组,且栀子苷起了主导作用,明确了全组分配伍组和黄芩苷+栀子苷(BJ)配伍能明显改善脑缺血的分子机制是调节了某些关键的通路,为方剂配伍的作用机制研究的方法学做了新的探索。


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