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中药荣肝合剂对刀豆蛋白A介导的免疫性肝损伤降酶效应的机制研究

张引强  
【摘要】: 目的: 1.理论研究,探讨清利活血健脾法与慢性乙型肝炎(CHB)的关系,为CHB的治疗提供立法依据,为荣肝合剂提供组方基础。 2.研究思路探讨,澄清“保肝降酶”治疗过程中的一些概念,明确其内涵,使中医药对CHB的治疗更为全面客观。 3.实验研究,探讨荣肝合剂对刀豆蛋白A(ConA)介导的急、慢性免疫性肝损伤小鼠的降酶效应及其机制。 4.临床病例观察,研究中药荣肝合剂对CHB患者生存质量的影响。 方法: 1.理论分析,收集古今、中西医相关文献,在回顾和总结的基础上,分析清利活血健脾法与CHB的关系,并与荣肝合剂相对应,分析其组方依据。 2.解析“保肝降酶”的内涵,分析中医药保肝降酶治疗CHB中存在的问题,探讨其应对措施。 3.(1)急性肝损伤实验:HBV转基因小鼠60只,随机分为6组(模型组、正常组、荣肝合剂组、茵陈蒿汤组、茵陈组、联苯双酯组),每组10只,采用ConA尾静脉注射制作急性免疫性肝损伤模型。造模前14天,模型组、正常组给予生理盐水灌胃,其余组分别给予:荣肝合剂、茵陈蒿汤、单味茵陈煎液、联苯双酯溶液,每日一次灌胃给药。末次给药后1h,正常组给予磷酸盐缓冲液(PBS)尾静脉注射,其余各组按照3μg/g剂量尾静脉注射造模。造模后8h,处死动物取血或组织标本检测ALT、AST、TBiL;观察病理组织学变化(HE染色);HBV DNA、HBsAg;肝组织MDA及SOD水平;肝组织内淋巴细胞亚群情况变化(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+);细胞凋亡相关基因(Fas、FasL、Bax、bcl-2);肝组织中TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-10等细胞因子的变化。 (2)慢性肝损伤实验:HBV转基因小鼠69只,随机分为正常组10只(尾静脉注射PBS 0.3ml)和ConA造模组59只,采用ConA6μg/g剂量尾静脉注射制作慢性免疫性肝损伤模型。造模结束后,将所有ConA造模组小鼠随机分为模型组、荣肝合剂组、茵陈组、茵陈蒿汤组及联苯双酯五组。各组小鼠每日灌胃给予相应药物,正常组与模型组给予生理盐水灌胃,共给药28天。末次灌胃给药后24h处死动物,取血或组织标本检测指标(指标同急性肝损伤实验)。 4.采用随机对照研究。区组随机,以荣肝合剂为治疗药物,与西药口服抗病毒药核苷(酸)类似物(NUCs)为对照,治疗期为6个月,以3个月为一访视点,考核患者血清ALT、AST、HBV DNA水平变化,结合普适性量表SF-36及慢性肝病问卷(CLDQ)观察荣肝合剂对于CHB患者生活质量的影响。结果: 1.CHB属本虚标实之证,湿热、血瘀为标,脾虚为本。或见肝郁,久则及肾。 2.CHB的保肝降酶未真正做到降低酶学指标与肝组织学改善并重,未结合抗病毒、提高免疫力、防止纤维化的治疗、少有关注患者生存质量。 3.(1)急性肝损伤实验:①ALT、AST、TBiL情况:与正常组比较,模型组小鼠血清ALT、AST、TBiL均显著升高(P0.01)。荣肝合剂、联苯双酯均可显著降低血清ALT、AST (P0.01),荣肝合剂可降低TBiL (P0.01)。②病理组织学变化:与模型组比较,荣肝合剂组肝细胞变性、坏死及炎细胞浸润程度较轻,显示其对肝组织的病理损伤有较好的改善作用(P0.05);而联苯双酯组、茵陈组与模型组的病损程度相似。③HBsAg、HBV DNA变化:荣肝合剂组HBVDNA与茵陈组比较有显著性差异(P0.05),其余指标各组比较无显著性差异。④MDA、SOD变化:与正常组相比较,模型组肝组织中SOD水平明显低于正常组,MDA水平则明显高于正常组(P0.05)。荣肝合剂组可明显提高肝组织中SOD水平,且与各干预组比较均有显著性差异(P0.01)。荣肝合剂、茵陈汤可降低肝组织中MDA水平(P0.05)。⑤淋巴细胞亚群变化:CD4+CD8-T淋巴细胞所占比例,各药物干预组与模型组比较均有升高,以荣肝合剂最著,比较有显著性差异(P0.05)。CD4-CD8+T细胞所占比例,荣肝合剂组与模型组、联苯双酯组比较有显著性差异(P0.05)。CD4+/CD8+T细胞比例变化,与模型组相比,各中药组均可见较大幅度升高,荣肝合剂组与茵陈蒿汤组比较有显著性差异(P0.05)。⑥Fas、FasL、Bax、bcl-2的变化:正常组中,FasL和Bax没有表达,模型组Fas和bcl-2的表达水平与正常组比较,均有显著差异(P0.05)。与模型组比较,荣肝合剂组Fas、FasL、Bax、bcl-2、bcl-2/Bax比值等差异有统计学意义(P0.05)。⑦TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-10的表达:模型组TNF-α、IFN-γ水平明显高于正常组,而IL-4, IL-10水平明显低于正常组(P0.05)。荣肝合剂组TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-10均较模型组有统计学差异(P0.05)。 (2)慢性肝损伤实验:①ALT、AST、TBiL情况:与正常组比较,模型组小鼠血清ALT、AST、TBiL均显著升高(P0.01)。荣肝合剂、联苯双酯均可显著降低血清ALT、AST及TBiL (P0.01)。②病理组织学变化:荣肝合剂组、茵陈蒿汤组与模型组比较,在减轻肝细胞坏死、减少变性、减轻炎细胞浸润以及减轻肝纤维化方面有统计学差异,荣肝合剂的作用优于茵陈蒿汤(P0.05)。③HBsAg、HBV DNA变化:荣肝合剂组HBV DNA水平与模型组比较有显著性差异(P0.05);HBsAg方面,荣肝合剂组与其余各组比较均有显著性差异(P0.05)。④MDA、SOD变化:模型组肝组织中SOD含量明显低于正常对照组,MDA水平明显高于正常对照组,并有显著性差异(P0.01)。荣肝合剂组MDA、SOD均较模型组有统计学差异,较其余组比较部分有显著差异(P0.05)。⑤肝组织中淋巴细胞亚群变化:CD4+CD8-T淋巴细胞,各药物干预组与模型组比较,均有升高(P0.05);荣肝合剂与茵陈、茵陈蒿汤、联苯双酯比较,均有显著性差异(P0.05);CD4-CD8+T细胞,荣肝合剂组、联苯双酯组与模型组比较,有显著性差异(P0.05);CD4+/CD8+T细胞比例变化,与模型组相比,各中药组均可见较大幅升高,荣肝合剂组与茵陈蒿汤组、联苯双酯组比较有显著性差异(P0.05)。⑥Fas、FasL、Bax、bcl-2的变化:正常组中,FasL和Bax没有表达,模型组Fas和bcl-2的表达与正常组比较,均有显著差异(P0.05)。荣肝合剂组Fas、FasL、Bax、bcl-2、bcl-2/Bax比值均较模型组有统计学差异,较其余组比较部分指标有显著差异(P0.05)。⑦TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-10的表达:模型组TNF-α、IFN-γ水平明显高于正常组,而IL-4、IL-10水平明显低于正常组(P0.05)。TNF-α,荣肝合剂、茵陈组与模型组比较,均有显著性差异(P0.05)。IFN-γ,各药物干预组与模型比较,均有显著性差异(P0.01),荣肝合剂组与茵陈组、联苯双酯组比较,均有显著性差异(P0.05)。IL-4,各药物干预组与模型比较,均有显著性差异(P0.05)。IL-10,荣肝合剂、茵陈组与模型组比较,均有显著性差异(P0.05)。 4.治疗3个月,两组患者的ALT、AST的复常率均在80%以上,组间比较无统计学差异(P0.05)。荣肝合剂与NUCs对HBV DNA均有降低作用,但NUCs则明显优于荣肝合剂(P0.05)。治疗6个月后,两组患者的ALT、AST水平均已降至正常值上限以下,组间比较无统计学差异(P0.05);HBV DNA方面,荣肝合剂和NUCs对HBV均持续发挥抑制作用(P0.05),但NUCs的HBV DNA阴转率明显高于荣肝合剂(P0.05)。生活质量改善方面:①治疗3个月,荣肝合剂组患者生活质量各个维度均有改善;而服用NUCs在生理职能、情感职能维度无明显改善;组间比较显示,荣肝合剂三个月治疗后,患者的生理机能、生理职能、精力、生理内容综合测量、心理内容综合测量、SF-36总分、CLDQ各维度均较NUCs有明显的改观(P0.05)。②治疗6个月:荣肝合剂对于患者生活质量的改善持续起效,较基线与治疗3月均有明显好转(P0.05);NUCs对CHB患者生活质量亦有改善,但与基线比较,生理职能、情感职能和躯体疼痛维度无统计学差异;较治疗3月,躯体疼痛、社会功能、一般健康状况及情感职能、生理内容综合测量维度无统计学差异(P0.05);组间比较显示,荣肝合剂与NUCs对患者生存质量的影响,除腹部症状维度外,荣肝合剂均优于NUCs (P0.05)。 结论: 1.CHB治则当以清热利湿、活血化瘀、健脾扶正为大法,荣肝合剂立法与此一致,与慢性乙型肝炎病机相契合。 2.CHB的保肝降酶治疗要真正做到对肝脏组织学的改善与降低酶学指标并重,并应该结合抗病毒、提高免疫力、防止纤维化发生、提高患者生存质量,并要加强临床研究。 3.通过本研究的进行,可得出以下结论:①荣肝合剂的保肝降酶作用不仅是对于外周血中酶的水平的降低,同时有伴有病理组织学的改善:减轻细胞炎症、坏死及炎细胞浸润、甚至逆转纤维化的作用。②中医药复方荣肝合剂的保肝降酶作用要明显优于单味中药(茵陈汤)和联苯双酯,清利活血健脾的治则对于乙肝的干预是有效的。③中医药保肝降酶作用起效的病理机制是多方面的:可减轻细胞膜脂质过氧化反应,提高淋巴细胞亚群功能,减少炎症因子的刺激、抑制肝细胞的凋亡。 4.中药荣肝合剂可使CHB患者的ALT、AST复常并降低HBV DNA的载量,但其抗病毒能力弱于NUCs。荣肝合剂可提高患者的生活质量,其作用优于NUCs的治疗。


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