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血液制品人细小病毒B19污染情况调查及新型病毒灭活方法研究

王敏  
【摘要】:人细小病毒B19(human parvovirus B19,简称B19),是已知唯一对人类致病的细小病毒,病毒无包膜、耐热,直径小(18~20 nm),基因组为线性单链DNA分子,约5.5kb。B19病毒有普遍易感性,可通过呼吸道传播,晚冬和早春是感染高峰,几乎成世界范围分布。又因其具有直径小和耐热的特性,对现有的血液制品生产工艺中采用的病毒灭活和去除方法具有较高抵抗力,现有生产工艺生产的血液制品存在一定的B19病毒污染风险。因此,加强原料血浆筛查以降低生产用原料血浆病毒含量是确保制品安全性的重要手段之一。PCR技术具有操作简便、结果直观、重复性好、特异性强、能准确定量等优点。因此本研究课题的第一部分内容是,用实时荧光定量PCR方法对国内原料血浆及血制品病毒的污染情况进行了调查分析,以期为血液制品生产工艺改进和质量控制提供依据。其中2276份献浆员血浆样本,9份初筛阳性,对初筛阳性样本复测3次,确认阳性4份。对血液制品成品进行检测,静注人免疫球蛋白样本84批,均为阴性;人纤维蛋白原样本14批,1批确认阳性;人凝血因子Ⅷ样本25批,9批确认阳性;人凝血酶原复合物样品24批,18批确认阳性。本研究阳性结果与国外文献报道结果较为一致,为今后进一步研究奠定了良好基础。 传统血液制品病毒灭活工艺如加热法、S/D、低pH法对脂包膜病毒灭活效果较好,对非脂包膜病毒灭活效果较差或无效。近年来,针对非脂包膜病毒的灭活方法也不断涌现,如纳米膜过滤法,热灭活法等,但这些方法对人细小病毒B19效果欠佳。本研究课题的第二部分内容是,建立一种全新的短波紫外线病毒灭活方法,采用UVC灭活仪UVivatec(为德国拜耳与赛多利斯联合开发研制)对血液制品中的模拟病毒—猪细小病毒(PPV)进行灭活验证。设定紫外辐射剂量分别为200、250和300J/m2,用微量细胞病变法检测残余病毒滴度,对灭活效果加以验证,获得满意效果。短波紫外UVC法可使PPV病毒滴度降低4log以上,符合病毒灭活验证指南的要求。 本研究课题第三部分内容是,短波紫外UVC病毒灭活方法对人凝血酶原复合物产品质量的影响研究。通过对UVC灭活处理前后的样品进行活性测定和比对分析,发现在没有添加任何保护剂的情况下,凝血因子活性回收率大于70%。为排除蛋白质发生结构的细微变化,我们同时运用二维电泳(2-DE)、高效液相色谱技术(HPLC)平台对其进行评价。HPLC分析结果证实,UVC照射后,蛋白聚合体含量无明显改变,与照射前比较,蛋白的色谱行为基本一致;2-DE检测显示,样品灭活处理后,图谱蛋白斑点数量基本相等,蛋白点大小及位置基本一致。 人细小病毒B19具有普遍易感性,对免疫力较低的患者具有潜在的致病威胁,献浆员含病毒的单个单位血浆有使整个血浆池污染的潜在危险,短波紫外UVC对无胞膜病毒灭活效果较好。为排除短波紫外UVC照射使蛋白质形成聚合体或裂解成小的蛋白碎片,进而引起其活性功能的改变的影响,我们用活性检测方法和2-D及SEC-HPLC对灭活处理后样品中蛋白质功能与结构进行了研究,使各种检测方法互为补充,获得了较满意的结果。样品在UVC灭活前后活性稳定,活性回收率均在70%以上,灭活前后以及不同灭活剂量间差异小,且活性在药典参考范围内。短波紫外线对无包膜病毒的灭活优势凸显出来,也为我们提供了新的思路和方法。


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