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以假病毒为基础的人乳头瘤病毒(HPV)中和抗体检测方法和动物感染模型的建立及初步应用

吴雪伶  
【摘要】: 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持续感染是引起宫颈癌和生殖器疣的最主要原因,开发、研制HPV预防性疫苗是预防HPV感染的最根本手段。判断预防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的体液免疫反应,因此建立稳定的、有效的中和抗体检测方法是评价HPV疫苗免疫原性的重要手段。本课题的主要研究目的就是建立以假病毒为基础的体外HPV中和抗体检测方法并对其进行初步应用。 将密码子优化的L1、L2基因表达质粒和含GFP基因的报告质粒共转染293FT细胞,共制备了六种型别假病毒(HPV16,HPV18,HPV58,HPV45,HPV6和HPV11),假病毒滴度用TCID50表示,分别为10~(7.38)/100μl,10~(6.57)/100μl,10~(6.59)/100μl,10~7/100μl,10~(6.33)/100μl,10~(4.8)/100μl。选择200~300TCID50/50μl的假病毒接种量,建立了以HPV16,HPV18,HPV58,HPV45,HPV6和HPV11六种型别假病毒为基础的HPV中和抗体检测方法。 用该方法对不同HPV58L1 DNA疫苗(L1h、L1hΔc、L1S、L1SM和L1wt)所诱导的中和抗体进行检测。各疫苗均以pcDNA3.1为载体,L1h含有密码子优化的L1基因;L1hΔc含羧基端截短的密码子优化的L1基因;L1S为pcDNA3.1中克隆入p58LLw中的L1基因;L1SM为突变型L1S,在构建L1S时,L1基因第485位碱基G突变为A;L1wt含有野生型HPV58 L1基因。结果显示L1S和L1h可诱导小鼠产生中和抗体,L1S诱导的中和抗体的平均滴度为6400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为48),但其他三种DNA疫苗(L1hΔc、L1SM和L1wt)不能诱导小鼠产生中和抗体,说明含不同基因片段的DNA疫苗诱导中和抗体的能力不同。 用该方法对不同人群血清中HPV型特异性中和抗体进行了检测,结果显示在82份宫颈癌患者血清样本中,中和抗体阳性率为28.0%,中和滴度在160~640之间,其中HPV16中和抗体阳性样本超过80%。在50份其他妇科疾病患者血清样本中,只检出一份HPV6中和抗体阳性样本,中和滴度为2560,中和抗体阳性率仅为2%,与宫颈癌患者中和抗体阳性率的差异具有统计学意义(X~2)=16.1,P0.05)。在生殖器疣患者血清样本中,HPV型特异性中和抗体阳性率为36.0%,阳性样本中和抗体滴度在160~2560之间,中和抗体阳性样本中,HPV6中和抗体阳性样本占66.7%。 利用凯普核酸扩增分型试剂盒进行HPV核酸检测及型别分析,结合血清HPV16、HPV18、HPV58、HPV45、HPV6和HPV11中和抗体检测结果,分析中和抗体和HPV DNA的关系。在182份样本中,共有114(62.6%)份样本HPVDNA阳性,42(23.1%)份样本中和抗体阳性,DNA和中和抗体检测结果的一致性为49.5%,二者检出率之间的差异具有统计学意义(X~2=56.3,P0.05)。其中,中和抗体和HPV DNA均为阳性的样本占17.6%,中和抗体阳性而HPV DNA阴性的样本占5.5%,中和抗体阴性而HPV DNA阳性的样本占45.1%,中和抗体和HPV DNA均为阴性的样本占31.9%。在中和抗体阳性样本中,DNA阳性样本和DNA阴性样本所对应的中和抗体滴度的几何均值分别为281.0和422.2。HPV16 DNA与HPV16型特异性中和抗体之间的检出率的一致性为65.9%,二者之间的差异具有统计学意义(X~2=31.2,P0.05)。 建立HPV假病毒小鼠感染模型,为HPV感染干预研究、疫苗评价及预防药物的筛选奠定基础。将密码子优化的HPV衣壳蛋白基因表达质粒和荧光素酶报告基因表达质粒共转染293FT细胞,48小时后收集裂解细胞,收获假病毒,并对假病毒滴度进行测定,HPV16、HPV45、HPV58和HPV6滴度分别为3.7×10~8TU/ml,1.5×10~8TU/ml,1.2×10~8TU/ml和3.3×10~7TU/ml。试验小鼠皮下注射甲羟孕酮醋酸酯,4天后阴道灌注壬苯醇醚-9,并在6小时后阴道灌注假病毒,7天后阴道灌注荧光素酶底物,并检测荧光素酶报告基因的表达情况。HPV16、HPV45、HPV58和HPV6小鼠模型15μl假病毒感染量的荧光信号强度分别为1.779e+06p/s,1.829e+06 p/s,5.738e+05 p/s和5.718e+05 p/s,5μl假病毒感染量荧光信号强度分别为3.715e+05 p/s,3.715e+05p/s,3.942e+05 p/s和0 p/s。 我们利用退火时间逐渐延长的两步PCR法,以棉拭子中提取并分型的DNA为模板成功扩增出片段大小约8kb的9种型别的HPV全基因序列,包括HPV16,HPV58,HPV11,HPV33,HPV59,HPV52,HPV53,HPV42和HPV68,各全基因序列均被成功克隆入pEASY-T3克隆载体中,测序及同源性分析结果显示,本试验中扩增得到的HPV16,HPV58,HPV11,HPV33,HPV59,HPV52,HPV53,HPV42全序及L1序列均与GENEBANK中已知序列具有99%左右的同源性,为已知型别的变异体,得到的HPV68全序与HPV68a的同源性为93%,而与ME180-HPV(HPV-68b)的同源性为99%,其L1读码框序列与HPV68a和ME180-HPV L1读码框核苷酸序列的同源性分别为92.6%和99.5%,据此判断该全序为HPV-68b。


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