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低聚果糖生产相关酶的分离纯化及性质研究

杨正茂  
【摘要】: 低聚果糖是一种在高等植物和微生物中分布甚广的天然寡聚糖。通常所指的低聚果糖是通过β-(2-1)糖苷键在蔗糖分子的果糖残基上连接1~3个果糖分子而形成的果糖寡聚体蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。由于低聚果糖具有难消化、低热量、抗糖尿病、降血脂、增殖双歧杆菌、抗龋齿及美容等独特的生理功能,现已作为一类重要的保健食品和蔗糖替代品广泛使用。工业上,主要以高浓度蔗糖作底物用微生物酶法生产低聚果糖。 本实验室筛选到了一株低聚果糖高产菌黑曲霉SIPI-602。我们采用凝胶过滤层析的方法对黑曲霉SIPI-602转化蔗糖的产物进行了分离纯化,得到了在HPLC上呈单峰的三聚糖和四聚糖,其保留时间分别与蔗果三糖和蔗果四糖一致。并且用~(13)C-NMR和MS对其结构进行了鉴定,确定它们分别为蔗果三糖和蔗果四糖。 在低聚果糖生产过程中,发生转移反应的同时往往会出现水解反应,影响了低聚果糖的转化率和产品中低聚果糖的含量。但目前对水解反应的本质尚未取得共识。一般认为,催化水解反应和转移反应的是同一个酶,但对于这一酶的归属有不同的观点,有人认为它属于转移酶,也有人称其为糖苷酶;还有个别学者认为水解反应为杂酶污染所致。为了加深对低聚果糖生产相关酶的了解,我们对黑曲霉SIPI-602产生的与低聚果糖生产相关的酶进行了分离纯化和性质研究。分离到了β-果糖基转移酶和β-呋喃果糖苷酶两个酶,其中β-果糖基转移酶可以催化蔗糖分子上果糖基的转移,生成低聚果糖;而β-呋喃果糖苷酶则可以将蔗糖和低聚果糖水解成葡萄糖和果糖。这有助于确定低聚果糖产生酶的归属和解释低聚果糖生产过程中的水解反应。此外,应用β-果糖基转移酶纯酶对提高低聚果糖的转化率以及进一步研究高浓度低聚果糖的生产均有重要意义。 低聚果糖生产相关酶的分离纯化包括用球磨机破碎细胞、硫酸铵分级沉淀、Octyl-Sepharose CL-4B疏水层析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶过滤层析等步骤。两个蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单带,用SDS-PAGE测得β-果糖基转移酶和β-呋喃果糖苷酶的分子量分别为98.86KD和84.92KD。 一 日一果糖基转移酶催化蔗糖转化成蔗果三糖的Km和Vmax分别为0.78mol/L 和斗.30mmol/min/L;将蔗果三糖转化成蔗果四糖的 Km和 Vmax分别为 0.34mol/L 和 0二ommol/min/L。葡萄糖是 p一果糖基转移酶的竞争性抑制剂,其 Ki= 1.36mol几。6一果糖基转移酶反应的最适pH和最适温度分别为牛5~6.0和 55 ’C。6一果糖基转移酶在中性条件、50oC以下稳定性良好。6一果糖基转移酶转化 蔗糖生成低聚果糖的反应进程实验表明,高浓度的底物有利于提高反应速度和转化 率,产物中果糖含量亦较低,说明提高底物浓度可以抑制水解反应的发生。 旦一陕哺果糖苦酶水解蔗糖生成葡萄糖和果糖的 Km和 Vmax 值分别为 0.025mol/L和 l.39。mol/min/L。葡萄糖对6一吱哺果糖昔酶没有影响;而果糖是 6一味g南果糖昔酶的竞争性抑制剂,Ki=10.05mmol/L。fi一味哺果糖苦酶在酸性 条件稳定,反应活性高。6一映哺果糖昔酶在40℃活力最高,在65℃以下稳定。 通过对菌丝体、6一果糖基转移酶与p一吠哺果糖苦酶的混合物及纯的p一果糖基 转移酶转化蔗糖生成低聚果糖的反应进程的比较,考察了p一陕哺果糖昔酶对p一 果糖基转移酶反应进程的影响。结果表明6一吠哺果糖苦酶对低聚果糖生成速率和 最终产率均有影响。结果还提示在用菌丝体转化蔗糖过程中低聚果糖可能会诱导出 更多的6一味哺果糖苦酶。


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