收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

顶头孢霉转化系统的构建与应用

张丕燕  
【摘要】: 过去的50年中,β-内酰胺类抗生素的工业发酵生产成为生物技术应用最成功的范例。目前,β-内酰胺类抗生素的全球销量已达到150亿美元,占整个抗生素市场的65%。在增加产量和大幅度地降低生产成本方面,最主要的β-内酰胺抗生素生产菌,产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和顶头孢霉(Acremonium chrysogenum or Cephalosporium acremonium)的菌种改良和发酵工艺的优化得到卓有成效的发展。传统的突变和选择、理性化筛选技术和原生质体融合技术最大可能地提高了β-内酰胺类抗生素生产菌的发酵产量;如今,现代生物技术的迅速发展正在成为菌种改良的又一有效工具。 丝状真菌顶头孢霉转化系统的建立是应用分子遗传方法研究顶头孢霉最为重要的先决条件之一。过去的一些研究表明质粒对顶头孢霉的转化率太低,限制了许多分子生物学技术的应用,如利用互补突变株从顶头孢霉的DNA文库筛选和鉴别基因、基因敲除或者基因替换(gene replacements)。而一个有效的转化载体在一定程度上取决于载体上选择标记上游的启动子的强弱,因此,在构建一个真菌的转化载体时,克隆合适的启动子序列是必需的。 酵母-大肠杆菌穿梭质粒pGBT9上的Trp1基因互补了色氨酸营养缺陷型啤酒酵母Y153(Saccharomyces cerevisiae Y153)的色氨酸合成能力。利用质粒pGBT9构建了一个用于筛选具有真菌启动子功能的DNA片段的捕获载体pGBT14。该质粒上的两个Trp1基因“头对头”相连,中间有一个BamHI单克隆位点但没有启动子序列,携带pGBT14的啤酒酵母Y153不能在无色氨酸的完全极限省却培养基(complete minimal dropout medium)上生长。利用pGBT14在大肠杆菌中构建了带顶头孢霉0.5~2Kb片段的染色体DNA文库,将分离到的质粒导入啤酒酵母Y153中进行筛选鉴别,获得了24个能使TrpⅠ表达而互补色氨酸缺陷的顶头孢霉的染色体DNA片段。在啤酒酵母Y153中,来自顶头孢霉的这些外源DNA片段具有不同的启动Trp1基因表达的能力。 根据已发表的pcbAB-pcbC双向启动子序列设计了一对引物,从顶头孢霉染色体DNA中扩增出1.3Kb的DNA片段,序列测定及比对表明该DNA片段的两端序列与发表的pcbAB-pcbC双向启动子序列完全相同。利用启动子筛选质粒pUT715构建了两个转化载体pYG8和pYG9并转化顶头孢霉,根据其启动博莱霉素抗性基因的表达能力验证了这个pcbAB-pcbC双向启动子的强弱,证明pcbC的启动能力强于pcbAB。利用克隆的pcbAB-pcbC的双向启动子构建了带VHb基因的转化载体,它对顶头孢霉的转化率平均为9.8个/μg质粒DNA,与本实验室先前利用构巢曲霉的TrpC基因的启动子构建的顶头孢霉转化质粒pYG715/Vgb的平均0.5个转化子/μg质粒DNA相比,转化率有了显著的提高。 勿 摘要 利用 PCR技术从顶头跑霉染色体DNA中扩增了编码已驶COA:DAC乙酸转移酶的CofEF 基因。与已发表的序列进行比对发现有三个鹏发生了改变:77 T—C、451C—A、803 G—C, 导致了三个密码子的改变,它们分别是GTC--+GCC、GAT、AAT、CGG、CCG.其中,第一 个突变是沉默突变,后两个突变分别是Asp--+Asn,Afg、Pro.这些贻的突变是由于PCR 扩增的错误所致,还是本研究所用的工业菌株经长期菌种选育而产生的有益突变,有待进一 步证实。 以温控诱导表达载体 pws构建了 Cofsr基因的大肠杆菌表达载体 pixsB经高温诱导 后,SDS-PAGE电泳显示,在4lm:附近有明显的蛋白质条带,与已报道的乙酸COA:DAC .乙酸转移酶的大小一致。 CofEF基困编码的DAOC合成购羟化酶和CofG编码的DAC G&转移娜化头抱菌素C 生物合成的限速步骤.利用扩增的pCM8pC比双向启动子和博莱霉素抗性基因,构建了含 CofEF基因的载体质粒 pYG20,转化顶头跑霉时,转化率可达 14*个个g质粒 DNA.另外, 以宿主菌为对照分别对10个重组菌株进行了发酵试验,初步结果表明宿主菌的最高产量为 4.24 mg/ffil,重组菌的最高产量为 4.20 mg/ffil. 还尝试了根癌农杆菌介导的顶头跑霉的转化,每个转化平板可获得30-50个转化子,与 PEG介导的顶头抱霉的转化相比,每次转化试验能够获得更多的转化子,表明该方法是目前 . 最高效的转化顶头抱霉的方法.


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 骆红英;采用接种体混合物培养顶头孢霉M25提高头孢C的产量[J];国外医药.抗生素分册;2003年04期
2 毛振玛,马家瑛,徐欣,杨岚峰,陈肖庆;顶头孢霉C82—123菌株稳定性试验[J];中国抗生素杂志;1988年02期
3 肖信发,杨素云,王秀兰;顶头孢霉229与12的分生孢子及原生质体的形成和再生[J];中国抗生素杂志;1988年03期
4 毛振玛,马家瑛,于晓君,徐欣,陈肖庆;植物油对顶头孢霉在发酵过程中菌体形态变化与头孢菌素C产量的影响[J];中国抗生素杂志;1988年02期
5 刘红;刘艳;谢丽萍;朱宝泉;胡又佳;;顶头孢霉蛋白质组的制备[J];中国医药工业杂志;2011年06期
6 廖福荣;顶头孢霉生物合成头孢菌素C中限速步骤的识别[J];国外医药.抗生素分册;1994年05期
7 陆俊;杨倚铭;储炬;张嗣良;孟利钢;;基于参数相关分析的顶头孢霉新移种标准[J];中国医药工业杂志;2009年10期
8 程作;李强;王文雅;袁其朋;;顶头孢霉cefG基因的表达及抗体制备的研究[J];北京化工大学学报(自然科学版);2010年05期
9 陈丹;袁宁;胡又佳;朱春宝;赵文杰;朱宝泉;;顶头孢霉乙酰转移酶基因的克隆、表达和活性研究[J];中国抗生素杂志;2006年07期
10 徐学瑛,赵萃英;头孢菌素C产生菌顶头孢霉生物合成组分间动态变化的探索[J];中国抗生素杂志;1986年06期
11 徐威,朱春宝,朱宝泉,姚新生;丝状真菌顶头孢霉染色体DNA的提取[J];沈阳药科大学学报;2004年03期
12 廖福荣;;铵对顶头孢霉产生δ-(L-α-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶的影响[J];国外医药.抗生素分册;1989年01期
13 袁丽容,吴立奋,潘佳林,方雪萍;头孢菌素C产生菌顶头孢霉理性化筛选的研究[J];中国抗生素杂志;1988年04期
14 杨天任;发酵期间顶头孢霉细胞脂肪酸成分的变化与头孢菌素C产量的关系[J];国外医药.抗生素分册;1995年03期
15 Jinyou Zhang;廖福荣;;顶头孢霉C-10内ACV合成酶的碳源调节[J];国外医药.抗生素分册;1990年05期
16 周光邠;;在顶头孢霉发酵中碳源对异青霉素N合成酶和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的调节作用[J];国外医药.抗生素分册;1984年05期
17 周光邠;顶头孢霉的蛋氨酸类似物抗性变株合成头孢菌素C[J];国外医药.抗生素分册;1983年04期
18 丁煜;在发酵中控制头孢菌素C组分的生物学工艺基础[J];国外医药.抗生素分册;1989年04期
19 黄乐毅 ,宋克谦;β-内酰胺抗生素的合成和生物合成[J];中国抗生素杂志;1985年02期
20 李波;联机的HPLC法测定头孢菌素C及其发酵副产物[J];国外医药.抗生素分册;1991年05期
中国重要会议论文全文数据库 前9条
1 刘艳;龚桂花;朱春宝;朱宝泉;胡又佳;;头孢菌素C乙酰化酶在顶头孢霉中的表达[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
2 龙良鲲;刘钢;;谷胱甘肽还原酶基因glrA对顶头孢霉菌丝形态分化及头孢菌素C生物合成的影响[A];2010年中国科学院微生物研究所博士后学术年会暨第二届博谊论坛论文摘要集[C];2011年
3 卜友泉;杜刚;兰欢;艾青;崔涛;易发平;刘革力;宋方洲;;新基因PRR11与FAM33A共享双向启动子区域的鉴定与初步分析[A];重庆市生物化学与分子生物学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
4 朱祯;;棉花曲叶病毒双向启动子功能研究[A];全国植物分子生物学与生物技术学术研讨会论文集[C];2000年
5 丁家波;李延鹏;杨明;李中明;孙爱军;崔治中;;马立克氏病毒1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性的影响[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
6 林会;李太元;张翼;;对革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp.cynodotis菌中插入序列(insertion sequence)的研究[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
7 朱战波;刘存霞;金明兰;计越;常巧呈;袭莹;鲁会军;金扩世;金宁一;;共表达NDV F和HN基因的重组鸡痘病毒rFPV-FHN构建及其遗传稳定性[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
8 沈鹤;牛鹏霞;李新云;赵书红;樊斌;;猪骨骼肌shRNA文库的初步构建[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
9 梁睿;罗庆;金先庆;;快速直视筛选结缔组织生长因子特异RNA干扰序列的研究[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前7条
1 张丕燕;顶头孢霉转化系统的构建与应用[D];上海医药工业研究院;2003年
2 丁家波;马立克氏病病毒pp38基因及其上游双向启动子的生物学特性[D];山东农业大学;2005年
3 徐威;根癌农杆菌介导的vgb对β-内酰胺抗生素生产菌的转化[D];沈阳药科大学;2004年
4 霍雨猛;抗根结线虫基因的克隆、遗传转化及黑籽南瓜再生体系的建立[D];山东农业大学;2008年
5 谭俊;基于多尺度创新原理的工业微生物高通量筛选平台构建及应用研究[D];华东理工大学;2013年
6 孙爱军;马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究[D];山东农业大学;2009年
7 秦瑶;CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究[D];第三军医大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈妍;透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在顶头孢霉中的克隆与表达研究[D];河北农业大学;2011年
2 艾青;人PRR11和FAM33A基因双向启动子的初步鉴定与分析[D];重庆医科大学;2011年
3 李术娜;透明颤菌血红蛋白基因在顶头孢霉中的克隆与表达[D];河北大学;2006年
4 刘宇斌;用于顶头孢霉菌基因工程改造的相关工具的构建[D];北京化工大学;2009年
5 吴晓良;顶头孢霉的遗传育种方法初步研究和头孢菌素C发酵行为突变筛选[D];山东大学;2007年
6 孟国庆;头孢菌素C高产菌株选育及发酵特性研究[D];山东轻工业学院;2011年
7 唐敦武;头孢菌素C高产菌株筛选模型与生产工艺的研究[D];沈阳药科大学;2007年
8 张娜;山羊痘病毒(GTPV)高效表达载体的构建及其鉴定[D];石河子大学;2011年
9 胡雪松;抗除草剂草甘膦转基因水稻的鉴定和水稻启动子的分析[D];华中农业大学;2009年
10 杜淑涛;头孢菌素C生产菌顶头孢霉HC-4原生质体诱变选育的研究[D];河北农业大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 记者 赵引德;石药华药牵头攻克关键技术[N];中国化工报;2011年
2 记者 郭伟;我省两项“十一五”国家科技支撑计划获验收[N];河北日报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978