顶头孢霉转化系统的构建与应用

【摘要】： 过去的50年中，β-内酰胺类抗生素的工业发酵生产成为生物技术应用最成功的范例。目前，β-内酰胺类抗生素的全球销量已达到150亿美元，占整个抗生素市场的65％。在增加产量和大幅度地降低生产成本方面，最主要的β-内酰胺抗生素生产菌，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和顶头孢霉(Acremonium chrysogenum or Cephalosporium acremonium)的菌种改良和发酵工艺的优化得到卓有成效的发展。传统的突变和选择、理性化筛选技术和原生质体融合技术最大可能地提高了β-内酰胺类抗生素生产菌的发酵产量；如今，现代生物技术的迅速发展正在成为菌种改良的又一有效工具。 丝状真菌顶头孢霉转化系统的建立是应用分子遗传方法研究顶头孢霉最为重要的先决条件之一。过去的一些研究表明质粒对顶头孢霉的转化率太低，限制了许多分子生物学技术的应用，如利用互补突变株从顶头孢霉的DNA文库筛选和鉴别基因、基因敲除或者基因替换(gene replacements)。而一个有效的转化载体在一定程度上取决于载体上选择标记上游的启动子的强弱，因此，在构建一个真菌的转化载体时，克隆合适的启动子序列是必需的。 酵母-大肠杆菌穿梭质粒pGBT9上的Trp1基因互补了色氨酸营养缺陷型啤酒酵母Y153(Saccharomyces cerevisiae Y153)的色氨酸合成能力。利用质粒pGBT9构建了一个用于筛选具有真菌启动子功能的DNA片段的捕获载体pGBT14。该质粒上的两个Trp1基因“头对头”相连，中间有一个BamHI单克隆位点但没有启动子序列，携带pGBT14的啤酒酵母Y153不能在无色氨酸的完全极限省却培养基(complete minimal dropout medium)上生长。利用pGBT14在大肠杆菌中构建了带顶头孢霉0.5～2Kb片段的染色体DNA文库，将分离到的质粒导入啤酒酵母Y153中进行筛选鉴别，获得了24个能使TrpⅠ表达而互补色氨酸缺陷的顶头孢霉的染色体DNA片段。在啤酒酵母Y153中，来自顶头孢霉的这些外源DNA片段具有不同的启动Trp1基因表达的能力。 根据已发表的pcbAB-pcbC双向启动子序列设计了一对引物，从顶头孢霉染色体DNA中扩增出1.3Kb的DNA片段，序列测定及比对表明该DNA片段的两端序列与发表的pcbAB-pcbC双向启动子序列完全相同。利用启动子筛选质粒pUT715构建了两个转化载体pYG8和pYG9并转化顶头孢霉，根据其启动博莱霉素抗性基因的表达能力验证了这个pcbAB-pcbC双向启动子的强弱，证明pcbC的启动能力强于pcbAB。利用克隆的pcbAB-pcbC的双向启动子构建了带VHb基因的转化载体，它对顶头孢霉的转化率平均为9.8个／μg质粒DNA，与本实验室先前利用构巢曲霉的TrpC基因的启动子构建的顶头孢霉转化质粒pYG715／Vgb的平均0.5个转化子／μg质粒DNA相比，转化率有了显著的提高。 勿 摘要 利用 PCR技术从顶头跑霉染色体DNA中扩增了编码已驶COA：DAC乙酸转移酶的CofEF 基因。与已发表的序列进行比对发现有三个鹏发生了改变：77 T—C、451C—A、803 G—C， 导致了三个密码子的改变，它们分别是GTC－－＋GCC、GAT、AAT、CGG、CCG．其中，第一 个突变是沉默突变，后两个突变分别是Asp－－＋Asn，Afg、Pro．这些贻的突变是由于PCR 扩增的错误所致，还是本研究所用的工业菌株经长期菌种选育而产生的有益突变，有待进一 步证实。 以温控诱导表达载体 pws构建了 Cofsr基因的大肠杆菌表达载体 pixsB经高温诱导 后，SDS－PAGE电泳显示，在4lm：附近有明显的蛋白质条带，与已报道的乙酸COA：DAC ．乙酸转移酶的大小一致。 CofEF基困编码的DAOC合成购羟化酶和CofG编码的DAC G＆转移娜化头抱菌素C 生物合成的限速步骤．利用扩增的pCM8pC比双向启动子和博莱霉素抗性基因，构建了含 CofEF基因的载体质粒 pYG20，转化顶头跑霉时，转化率可达 14＊个个g质粒 DNA．另外， 以宿主菌为对照分别对10个重组菌株进行了发酵试验，初步结果表明宿主菌的最高产量为 4．24 mg／ffil，重组菌的最高产量为 4．20 mg／ffil． 还尝试了根癌农杆菌介导的顶头跑霉的转化，每个转化平板可获得30－50个转化子，与 PEG介导的顶头抱霉的转化相比，每次转化试验能够获得更多的转化子，表明该方法是目前 ． 最高效的转化顶头抱霉的方法．