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依尼奥小单孢菌原生质体融合育种及其分子生物学研究

洪文荣  
【摘要】:西索米星,临床上重要的的氨基糖苷类抗生素,属4,6—双取代2—脱氧链霉胺类抗生素,由依尼奥小单孢菌产生。本研究采用细胞融合和分子生物学技术对依尼奥小单孢菌进行研究。筛选到了西索米星高产菌种S96,并从中克隆到了西索米星高抗性基因sisR。 从产抗生素的伊尼奥小单孢菌T125的原生质体融合试验研究中得到了菌株S96,根据培养特征比较,其菌丝形态,斜面培养,碳源利用和浸没培养等特征均不同于出发菌株。菌株S96几乎不产生色素,不利用可溶性淀粉,不产生孢子。其浸没培养的优良特征是出发菌所没有的。 对菌株S96的培养特性进行了研究,应用正交试验和数理统计对发酵培养进一步优化,精选出一组适合于S96发酵生产的培养基配方。根据溶氧曲线,优化发酵工艺,获得了一套较适合于菌株S96的代谢曲线特性,按照该曲线特性进行调控,可使西索米星的中试生产水平接近于摇瓶的生产水平,西索米星最高发酵单位可达1600μg/ml。 从产西索米星的依尼奥小单孢菌中克隆高抗性新基因sisR。以grmA基因(来自产庆大霉素的绛红色小单孢菌的抗性基因)为模板,设计PCR引物,从西索米星的产生菌依尼奧小单孢菌的染色体DNA中,经PCR扩增获得了序列长度不等的DNA片段。将这些DNA片段克隆至pUC19载体质粒并导入大肠杆菌,从中筛选到5个抗西索米星的转化子,其中一个命名为pLY102(插入片段命名为LY102,含sisR基因),显示对西索米星的高抗性(超过1000μg/ml)。经DNA测序并通过互联网Blast比对,确认对该抗性负责的DNA片段是一个未见报道的新基因。 将全长为849bp的LY102片段克隆到pUC19/18载体上构建质粒,抗性基因sisR依靠它自带的启动子和核糖体位点(GGAGG)在大肠杆菌DH5α中表达。基因sisR的表达不受载体上lacZ启动子的控制,其转录是自动发生的。序列中含有两个开放阅读框(orf),对抗性负责需两个orfs协同作用。将预测的sisR基因的氨基酸序列与16SrRNA甲基化酶的氨基酸序列比对表明:与grmB(来自玫瑰小单孢菌甲基化酶基因)、grmA(绛红色小单孢菌甲基化酶基因)和sgm(来自兹昂小单孢菌的甲基化酶基因)的氨基酸序列有很高的同源性,依次为92%、87%和85%。


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