抗肿瘤抗生素柔红霉素产生菌的基因组改组研究

【摘要】：选择育种(selective breeding)建立在两个亲本基因组杂交的基础上,多年来,成功地 应用于微生物菌种改良上;DNA改组(DNA shuffling)技术是一种在分子水平上模拟并加 快进化过程的方法,适用于单个基因或DNA片段的定向进化;基因组改组(genome shuffing)技术是一种结合了DNA改组的多亲本杂交优势和传统育种的整个基因组重组的 细胞水平上的育种过程。 本工作研究了应用基因组改组技术提高柔红霉素产生菌的发酵水平,研究结果如下: 试验了发酵液中柔红霉素的不同提取和测定条件,经优化后的分析方法,能够满足发 酵复筛的大批量快速、准确的测定。 研究了天蓝淡红链霉菌SIPI 1482M1原生质体的制备、再生和融合方法。 首先,使用原生质体紫外诱变方法得到发酵水平略有提高的群体,然后通过反复库原 生质体融合在这一群体中进行改组;同时进行了非改组的对照实验,即反复的原生质体制 备和再生,而不经过PEG融合。 出发菌株SIPI1482 M1的自身产物耐受浓度仅为15μg/ml,经过四轮基因组改组后的 子代群体菌株,能耐受200μg/ml。而对照实验的菌株的耐受性为25μg/ml,由此表明基因 组改组关键在于PEG介导的反复多亲本的基因组融合。改组后所得的大量子代菌群在DNR 抗性平板上初筛,淘汰低耐受性菌株,挑取高耐受性突变株,摇瓶发酵复筛,HPLC测定, 柔红霉素发酵单位比出发菌株提高了约60%。 实验表明在一个菌群内进行反复基因组重组,能够有效产生重组菌株的组合文库,通 过选择实现定向进化。当基因组改组应用于一个有特定表型的菌株群体后,许多改组菌株 的特定表型有了显著的改良。本实验证明了基因组改组技术能够加快提高柔红霉素产生菌 对自身代谢产物的耐受性和其发酵产抗水平。由此可见,基因组改组这一新技术对工业微 生物的耐受性、产抗能力等复杂表型的提高有实际应用价值,特别对长期应用传统菌种改 良方法所得的工业菌株的选育开辟了新思路;它是细胞水平上的定向进化,有助于应用细 胞和代谢工程,提供了一个快速产生改良菌株的非重组方法。