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免疫相关基因在结核病和肺癌患者中的表达变化分析

赵雁林  
【摘要】: 目的 为了研究免疫相关基因在结核和肺癌组织中的表达变化,制作包含人体免疫相关基因的cDNA芯片。方法 采用多聚赖氨酸修饰玻璃载玻片进行接触式点样。结果 cDNA片段经测序证实一致,固定率大于25%,变异系数小于20%,经测试所有管家基因均有强的信号,阴性对照无信号。结论 此芯片可以用于表达谱分析。 前言 cDNA微阵列技术是研究不同生物体基因表达非常有效的工具,它已经被成功地用于同时分析成千上万基因表达分析、大规模的基因发现、基因多态性筛查、基因组DNA克隆做图等等。cDNA微阵列是一个高通量,可高效地平行分析基因表达的技术,可以定量分析已知或未知基因RNA转录水平,通过比较正常细胞和病变细胞基因表达图谱,能够提供一些具有诊断和治疗价值的特异性指标。cDNA微阵列技术可以同时分析许多基因的表达水平,能够提供推断基因功能和预测复杂细胞调节网络等信息。cDNA芯片,是将许多特定的基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并借助计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。为了研究免疫相关基因在结核和肺癌组织中的表达变化,我们制作包含人体免疫相关基因626个cDNA片段的cDNA芯片并对其进行测试。 材料和方法 一.芯片制备 扩增和构建侯选基因的cDNA片段 ①构建包含感兴趣基因的基因文库,在626个目的基因中,有336个由生物芯片北京国家工程研究中心提供,有152个由北京大学人类基因研究中心提供(Research Genetics Human cDNA Library),这些基因片段根据原构建载体选用通用载体和通用引物;其余138个基因片段自行构建,下面以IL-2为例阐述构建cDNA和表达纯化过程: 1.PCR技术扩增hIL-2cDNA:以自行构建的pGEM-hIL-2为模板(含全长人IL-2cDNA),以上海生工生物工程公司合成的5’GCACCTACTTCAAGTTCTAC 3’(Tm 58℃)为上游引物,以pUC/M13反向引物5’ACACAGGAAACAGCTATGAC 3’(Tm 58℃)为下游引物,利用基因工程菌制备的Taq DNA pol,以4种dNTP为底物,用Stratagene公司生产的RaboCycler96 Temperature Cycler PCR仪经94℃变性,58℃复性,72℃延伸,25个循环,生成hIL-2。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 2.质粒提取:用碱裂解法提取,产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 3.构建DNA重组体、酶切、连接和转化:用StyⅠ和HindⅢ限制性内切酶消化pKpL 3a质粒和hIL-2 cDNA,消化产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,用T4 DNA连接酶进行两个匹配粘端的连接。用CaCl2处理大肠杆菌,制备感受态;转化感受态的大肠杆菌。在LB液体培养基中扩增,用LA固体培养基筛选阳性转化的细菌克隆。 4.少量IL-2的诱导表达和产物鉴定:挑取少许对数生长晚期的细菌克隆,接种至LA液体


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