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支气管灌洗液基因过甲基化对肺癌诊断的研究

段鸿飞  
【摘要】: 每年全世界约100万人死于肺癌,在许多国家是因癌症死亡的主要原因。纤维支气管镜检查是诊断肺癌的有力武器,支气管灌洗不仅能稳定地提高肺癌检出率,而且价格便宜,此外,能研究常规支气管镜未见异常的肺部病变,有助于诊断呼吸道原发性或继发性恶性肿瘤,包括周围型肺癌,细支气管肺泡癌,肺转移癌,癌性淋巴管病,肺部淋巴瘤等,被称为“液相活检”。然而,多数周围型肺癌患者不能通过纤维支气管镜相关检查获得明确的病理学诊断,需要建立更敏感的分子生物学方法为肺癌的诊断提供帮助。 本研究选取北京胸部肿瘤结核病医院收治怀疑肺癌患者78例,包括肺癌51例,其中鳞癌23例,腺癌20例,小细胞癌5例,腺鳞癌3例,中心型肺癌27例,周围型肺癌24例,男性32例,女性19例,平均年龄(57.1±13.5)岁,良性病变患者27例,其中肺结核17例,肺炎5例,肺部良性肿瘤5例,男性16例,女性11例,平均年龄(39.5±10.7)岁。我们从支气管灌洗液上清和细胞提取DNA,对上清游离DNA进行定量分析,并采用敏感性较高的NMSP(nested methylation-specific PCR,巢式甲基化特异性PCR)完成对支气管灌洗液上清和细胞的过甲基化分析,探讨支气管灌洗液上清游离DNA用于原发性肺癌分子生物学诊断的可能性,以及支气管灌洗液过甲基化研究对肺癌诊断的应用价值。所选择的靶基因包括非小细胞肺癌过甲基化频率较高p16,MGMT(O6-methylguanine DNA methyltransferase,甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶),以及小细胞肺癌表达频率较高的RASSF1A基因(RAS-association domain family 1A,ras相关区域家族1A)。为证实NMSP结果,各取每个基因的一个甲基化片段和非甲基化片段克隆后测序。以临床诊断为金标准,将NMSP结果与其比较,计算敏感性和特异性。应用SPSS10.0统计软件进行分析,用单因素方差分析进行游离DNA量的比较,以P0.05为差异有显著性。 研究结果如下: 1中心型肺癌支气管灌洗液上清游离DNA量为(0.83±0.34)μg/ml,周围型肺癌为(0.66±0.31)μg/ml,肺部良性病变为(0.59±0.37)μg/ml,经单因素方差分析发现三者支气管灌洗液游离DNA量没有显著差异。 2 51例肺癌患者支气管灌洗液细胞学检查发现肺癌细胞7例,其中27例中心型肺癌患者4例支气管灌洗液发现肺癌细胞,24例周围型肺癌患者3例支气管灌洗液发现肺癌细胞。20例支气管灌洗液细胞学检查和过甲基化检测得到一致结论。6例支气管灌洗液发现肿瘤细胞,过甲基化分析至少一个基因阳性。14例灌洗液未发现肿瘤细胞,三个基因过甲基化分析均为阴性。31例支气管灌洗液细胞学检查和过甲基化检测得到不一致结论,30例细胞学检查为阴性,但过甲基化分析一个或一个以上基因为阳性。1例细胞学检查阳性但过甲基化分析阴性。 3 51例肺癌患者中,支气管灌洗液和上清研究过甲基化结果如下:对灌洗液细胞进行三种基因过甲基化研究诊断鳞癌、腺癌、小细胞癌和腺鳞癌的阳性比例分别为17/23(73.9%),13/20(65.0%),4/5,2/3。结合灌洗液上清和细胞进行过甲基化研究诊断鳞癌、腺癌、小细胞癌和腺鳞癌的敏感性分别为18/23(78.3%),15/20(75.0%),4/5,3/3。 4支气管灌洗液细胞过甲基化诊断肺癌的敏感性和特异性分别为70.6%和81.5%,诊断中心型肺癌的敏感性为85.2%,诊断周围型肺癌的敏感性为54.2%。支气管灌洗液上清和细胞过甲基化研究诊断肺癌的敏感性和特异性为78.4%和70.4%,诊断中心型肺癌的敏感性为88.9%,诊断周围型肺癌的敏感性为75.0%。结论支气管灌洗液上清对肺癌分子生物学诊断有一定帮助,抑癌基因的过甲基化可作为肺癌诊断有用的标记。


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