日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶的表达及其功能研究

【摘要】：血吸虫病是一种由血吸虫感染引起的严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病,在我国主要流行于长江中下游的12个省(市、自治区),目前仍有血吸虫病人40多万。血吸虫感染可造成人体器官的器质性变化,严重危害人体健康。由于血吸虫具有复杂的生活史,能不断更新自身表面抗原成份,并能对宿主免疫系统功能进行主动调节,因而拥有很强的免疫逃避能力,给血吸虫病疫苗的研制带来很大的困难。至今还没有具有实用价值的抗血吸虫感染疫苗问世,控制血吸虫病的流行仍主要依赖于化学治疗。 20世纪80年代吡喹酮的发现,使血吸虫病的治疗取得历史性的突破,随即取代其他药物,成为治疗血吸虫病的首选药物。血吸虫感染的伴随免疫”特征使得宿主不能形成持久的抗再感染免疫力,再感染后需要重复治疗。但反复用药易导致血吸虫产生抗药性。1994年,Doenhoff等已在实验室内诱导出曼氏血吸虫吡喹酮抗性株,而在曼氏血吸虫病流行的非洲及南美洲,也已发现曼氏血吸虫对吡喹酮的敏感性下降的现象,埃及血吸虫也出现了相似的情况。青蒿素类药物是治疗血吸虫病的另外一种药物,但是青蒿素类药物主要杀伤血吸虫童虫,对成虫效果不佳,且青蒿素类药物的大量使用会导致疟疾抗药性的产生,对疟疾的治疗带来挑战,因而限制了其使用。迄今为止除青蒿素之外,还没有可替代吡喹酮的治疗药物出现,因此迫切需要开发新的治疗血吸虫病药物。 近年来,生物体内氧化还原代谢平衡逐渐成为新药开发的一个重要靶点。寄生于宿主体内的病原体为了保持正常的生命活动,需要维持自身的氧化还原平衡,并抵抗来自宿主活性氧的损伤。在真核生物中,主要有两套抗氧化系统:硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统。这两套系统在维持细胞内的氧化还原平衡中发挥着重要作用。除参与机体的抗氧化作用外,这两套系统还与转录因子调节,细胞生长与分化,DNA合成,激素、细胞因子和硒蛋白代谢等许多重要的细胞生理功能相关。其中,硫氧还蛋白还原酶已成为抗肿瘤药、抗感染药物开发的重要靶标。 已有研究证实,在蠕虫(曼氏血吸虫和猪肉绦虫)体内,不存在单独的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶,该两种酶的功能被一种多功能酶—硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(TGR)所取代。通过RNAi干扰技术已经证实TGR是曼氏血吸虫生存所必须的基因。抑制曼氏血吸虫TGR的表达,虫体因不能抵抗氧化损伤而死亡。因此,TGR可能是一种非常有潜力的抗血吸虫感染的药物作用靶标。 目前关于日本血吸虫TGR的研究尚未见报道。本研究首次表达了日本血吸虫TGR硒蛋白,并对其活性与功能进行了研究,内容主要包括以下几个方面: 一、日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因克隆与多态性的研究 采用QuickPrep~(TM) mRNA purification kit抽提日本血吸虫成虫mRNA,按照Fermants公司Phusion~(TM) RT-PCR kit制备日本血吸虫成虫第一链cDNA。以曼氏血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SmTGR)的基因序列,通过Blast软件搜索日本血吸虫EST数据库,获得与SmTGR基因同源的日本血吸虫EST序列。根据搜索到的EST序列设计引物,从cDNA中扩增日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)基因片段,将PCR产物进行TA克隆并进行DNA序列分析。序列分析显示SjTGR是一种C末端含有保守序列GCUC的硒蛋白(U指的是硒代半胱氨酸),SjTGR基因中存在点突变、缺失等多态性改变。 二、表达日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶硒蛋白嵌合基因的构建 为制备具有生物活性的SjTGR蛋白,根据文献报道的硒蛋白表达策略,在SjTGR开放阅读框终止密码子UGA的末端融合一个大肠杆菌的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),形成一个嵌合基因。它可以在大肠杆菌中使硒代半胱氨酸准确地插入到SjTGR的终止密码子UGA所在的特殊位置形成硒蛋白,以便使在大肠杆菌中表达的SjTGR具有天然的酶活性。 三、日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶硒蛋白的表达及特性分析 将融合有大肠杆菌SECIS结构的SjTGR基因,亚克隆到表达载体pET41a中形成重组表达质粒SjTGRsec/pET41a。将重组表达质粒SjTGRsec/pET41a和质粒pSU ABC共转化到大肠杆菌BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)对处于静止生长期的细菌在24°C诱导24 h,可表达出可溶性的SjTGR蛋白。同位素~(75)Se掺入试验证实质粒pSU ABC表达产物可促进硒代半胱氨酸整合,增加SjTGR硒蛋白的产量。通过阿糖胞苷-2’, 5’-二磷酸琼脂糖凝胶亲和层析从表达产物中制备出纯化的重组SjTGR蛋白。用重组的SjTGR免疫小鼠得到高效价的抗SjTGR多克隆血清,免疫印迹实验证实日本血吸虫体内存在天然的TGR蛋白,而不存在单独的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶分子。 四、日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶酶动力学分析 利用紫外分光光度计(UV-2550, SHIMADZU),在25°C条件下,分别以5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB),胰岛素,氧化型谷胱甘肽(GSSG),β-羟乙基二硫化物(HED)为底物,测定SjTGR的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氧还蛋白(Grx)活性及各自的米氏常数。以金诺芬为抑制剂,测定其对SjTGR活性的抑制作用及抑制常数。结果显示SjTGR是一种具有TrxR, GR, Grx活性的多功能酶,酶活性分别为8.11μmol·min-1mg-1、2.19μmol·min-1mg-1和12.10μmol·min-1mg-1。不同的酶底物得到的Km值分别为21.42±0.44μM (NADPH)、3.24±0.40μM (Trx)、145.05±6.31μM (DTNB)、49.55±6.31μM (GSSG)、2.792±231μM (HED)、3.831±54μM (GSH)。金诺芬对SjTGR活性有明显的抑制作用,5 nM重组的SjTGR的TrxR、GR、Grx的半数抑制浓度(IC50)值分别为6.89、0.47、8.12 nM,TrxR、GR的抑制常数(Ki)分别为0.762 nM和0.034 nM。金诺芬对SjTGR的TrxR活性抑制作用为竞争抑制,而对SjTGR的GR活性抑制作用为非竞争抑制作用。 五、抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶活性的药物筛选及其毒性作用 取日本血吸虫成虫置于RPMI 1640培养基中,培养30 ~ 60 min后,加入不同浓度的药物(金诺芬、顺铂、阿霉素及化合物4N、H、B、O),分别于6、24、48、72 h观察虫体活力、形态改变及死亡情况。随后换无药物的新鲜培养基,观察虫体活力的恢复情况,并计算药物半数致死剂量(LD50)。测定药物处理后的成虫匀浆上清液中SjTGR的TrxR和GR的活性改变。每只小鼠经腹部感染日本血吸虫尾蚴30条,在血吸虫感染的各个阶段使用金诺芬和4N进行药物腹部注射治疗,治疗剂量为金诺芬6mg/kg,4N 45mg/kg,一天治疗2次,连续治疗5天。治疗阶段包括:①皮肤期(感染后第1天用药);②肺期(感染后第7天用药);③肝期(感染后第23天用药);④成虫期(感染后第35天用药)。对照组小鼠在相应感染阶段腹部注射等量溶剂(DMSO+生理盐水)。感染后42天剖杀小鼠,计算减虫率和减卵率。结果显示5μg/mL的金诺芬作用24 h、20μg/mL的化合物4N作用72 h、60μg/mL的化合物H作用72 h、80μg/mL的顺铂作用72 h对日本血吸虫成虫致死率分别为100%、60%、66.7%、100%,LD50值分别为2.56、17.59、54.14μg/mL和52.87μg/mL,其他药物对日本血吸虫无作用。金诺芬、化合物4N、顺铂、化合物H对成虫的毒性作用具有不可逆性;金诺芬、顺铂对日本血吸虫的TGR酶活性有抑制作用,其他药物对SjTGR无作用。5～30μg/mL金诺芬、20～30μg/mL 4N、70～150μg/mL顺铂及60～150μg/mL H作用24 h均可使虫体形态发生改变。体内治疗试验结果显示,金诺芬对日本血吸虫童虫无作用,但对日本血吸虫成虫有41.5%的减虫率和43.18%的减卵率(P值均 0.05)。4N对各期血吸虫均无作用。 六、日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶活性抑制肽的筛选与鉴定 将纯化好的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)包被于培养皿中(60×15 mm),与展示肽库噬菌体(1011 pfu)反应,用严谨条件洗涤未结合的噬菌体,再用NADPH洗脱特异性结合的噬菌体。洗脱的噬菌体扩增后再次与包被在酶标板上的SjTGR结合,进行第二次筛选。如此重复淘洗三次,获得与SjTGR结合的噬菌体克隆。测序结果显示,经过三轮淘洗后,在58个测序噬菌体克隆中共存在4种同源肽段,分别命名为:JIPDys1、IPDys2、JIPDys3、JIPDys4。其中JIPDys1存在于26个克隆中, JIPDys2存在于2个克隆中,JIPDys3存在于3个克隆中,JIPDys4存在于4个克隆中。ELISA、Western Blotting检测四种多肽均能与SjTGR结合,酶活性抑制试验显示肽JIPDys1、JIPDys2、JIPDys3具有抑制SjTGR活性作用,1011 pfu的三株噬菌体对SjTGR的TrxR,GR,Grx活性的抑制率分别为59.04%,80.80%,53.56%;45.24%,69.43%,25.64%;54.72%,20.88%,43.02%。肽JIPDys4对SjTGR活性不具有抑制作用。 结论 本研究成功制备出具有硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶和谷氧还蛋白活性的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)硒蛋白。体内、外抑制试验证明该蛋白是维持日本血吸虫氧化还原平衡的关键分子,是生命的必须基因,是血吸虫病治疗新药开发的潜在靶标。筛选到的具有抑制SjTGR活性的噬菌体展示肽为进一步开发具有自主知识产权的日本血吸虫病治疗新药奠定了基础。