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糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的相关研究

杨勇  
【摘要】:研究背景 勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是常见的泌尿男科疾病,困扰了全世界很大一部分男性。然而目前的治疗存在很大的缺陷,阴茎海绵体平滑肌的张力改变与阴茎勃起功能之间的关系已经得到了公认。而糖尿病与ED的发生关系密切,糖尿病已被公认为ED最重要的危险因子之一,ED更是糖尿病常见的并发症。糖尿病导致ED的发病机制是多方面的,其中血管因素在糖尿病性ED形成过程中起着很重要的作用。阴茎海绵体具有血窦结构,与血管系统具有很多相似性,因此被认为是一种特殊的血管类组织。阴茎海绵体平滑肌是海绵窦间隙舒张及阴茎勃起的结构基础,在正常阴茎勃起的血流动力学变化中,发挥着关键作用。 近年来,对于心血管疾病中平滑肌细胞所起的作用的研究越来越多,也越来越透彻。根据平滑肌细胞的结构和功能不同心血管平滑肌细胞分为分化型(differentiation)(收缩型)和增殖型(proliferation)(去分化型)这两种类型已毋庸置疑,其中分化型的主要功能是收缩和舒张,维持组织器官的正常形态结构和功能,而增殖型主要在细胞增生、迁移、分泌及降解胞外蛋白等方面发挥作用。有研究证明这两者类型在一定条件下可以相互之间转化,即我们提出来的表型转化。当血管受到损伤或体外培养的血管平滑肌细胞受到生长因子刺激时,血管平滑肌可从分化型转化为去分化型并获得增殖能力。由此我们联想到阴茎海绵体组织,其实阴茎海绵体组织是一种特殊的血管组织,它与心血管平滑肌细胞在功能上具有一定的相似性,是否阴茎勃起功能障碍大鼠的阴茎海绵体平滑肌细胞也存在表型转化,这种表型转化的分子调控机制是什么?暂时还不清楚。 要研究平滑肌细胞是否存在分化型与增殖型之间的转化,就得要区分平滑肌细胞不同的表型状态。不同表型的平滑肌细胞分别会表达一些不同的表型标志物,当平滑肌细胞发生表型转化时,这些标志物的表达量会相应的改变。特别是对收缩型表型的研究,今年来的文章越来越多,而且如果收缩型标志物的增多或者减少就代表着有着一定的表型转化这一观点被越来越多的人接受,收缩型平滑肌细胞包含有以下几种标志物:平滑肌α肌动蛋白(smooth muscleα-actin,α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chains, SM-MHC)、碱性调宁蛋白(calponin 1)及钙调节蛋白(h-caldesmon)等。 在查取大量的外文文献基础上,我们发现miR-145能参与心血管平滑肌细胞表型转化的调控,它的表达与平滑肌细胞的分化状态有关。在胚胎时期就可以在平滑肌细胞见到miR-145的表达,随着胚胎的成熟,平滑肌细胞表现为增殖改变,此时表达下调,出生后由于平滑肌细胞处于分化成熟状态,miR-145又表现为高表达状态。miR-145不仅具有诱导多能干细胞分化为血管平滑肌细胞的功能,且能调控平滑肌细胞使其处于分化状态。在血管损伤和动脉硬化中,miR-145表达下降,而恢复它的表达后,可见到平滑肌细胞增殖被抑制,而恢复到分化成熟状态。 因此,在得知阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的特性后,从阴茎海绵体表型转化的角度出发,探索影响阴茎海绵体表型转化的相关因子就成为研究ED发病机制和治疗手段的一个新思路。miR-145是一个主要存在在血管平滑肌细胞中与平滑肌细胞分化有关的非编码RNAs,因它对许多细胞的增殖和分化起着调控作用,我们提出是否也在阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化中起着应有的调控作用了?由于近年研究发现miR-145现对血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用,并同时可使血管平滑肌细胞从合成型向收缩型转化,即对血管平滑肌细胞表型转化有逆转作用。但miR-145对于与血管平滑肌细胞相类似的阴茎海绵体平滑肌细胞、特别是处于糖尿病状态下的阴茎海绵体平滑肌细胞是否也有抑制其增殖并逆转其表型转化的作用,国内外未见文献报道。 在研究过程中,对比miR-145在已经存在表型转化的糖尿病性阴茎勃起功能障碍大白鼠的阴茎海绵体中和正常阴茎勃起功能障碍大白鼠的阴茎海绵体中量的变化至关重要。miR-145在这之间量的改变可以从一定程度上说明这个小分子参与了阴茎海绵体平滑肌细胞的表型转化的调控,从一定程度上影响表型转化的过程,从而对糖尿病性大鼠阴茎勃起功能障碍形成过程产生作用。可进一步说明miR-145与糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体之间的关系。也许能说明miR-145为影响糖尿病性大鼠阴茎勃起功能障碍的一分子机制。 本课题研究立足于上述基础,首先从细胞水平验证糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞存在表型转化,然后从组织水平分析miR-145在各组阴茎海绵体中量的变化。先建立糖尿病性阴茎勃起功能障碍大鼠、糖尿病性勃起功能正常及正常的大鼠模型,模型建立后再在同样的条件下饲养8周,先取阴茎海绵体组织行细胞培养,培养至细胞的第二代,取其三组细胞的蛋白,进行western-blot定量检测各标志物表达量的变化,验证其表型转化的存在。然后取建立成功的大鼠模型的阴茎海绵体组织,提取其中的RNA,利用qRT-PCR的方法来测定各组阴茎海绵体组织中miR-145的表达量,通过有差异的表达量进而评估miR-145在糖尿病性阴茎勃起功能障碍大鼠中的作用。 目的 通过建立糖尿病性阴茎勃起功能障碍、糖尿病性阴茎勃起功能正常及正常大鼠的动物模型,了解糖尿病性阴茎勃起功能障碍大鼠生活习性及体征、患病症状的改变。三组大鼠在相同的环境下饲养8周,8周后,先取三组不同的大鼠阴茎海绵体组织行细胞培养,取第二代细胞的蛋白,检测其标志物表达量的改变,从蛋白水平验证其存在表型转化的特性。然后取三组动物模型的阴茎海绵体组织,利用分子生物学的基础方法检测miR-145在三组组织中量的表达,通过检测到的miR-145在三组组织中量的表达情况来了解其对糖尿病性阴茎勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体表型转化的影响,进而说明miR-145在糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体表型转化中的作用。 方法 1、26只雄性8周龄SD大鼠分为两组,于同一间动物房饲养,饲养3天适应动物房内环境后进行建模工作:(1)糖尿病组:14只,大鼠适应性饲养3天后,禁食不禁水12 h,腹腔注射内60mg/kg STZ(以pH 4.0的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制);(2)正常对照组:12只,仅注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。分别于72h、1w、2w后采用割尾法采血测血糖,以随机血糖水平16.7 mmol/L为糖尿病动物建模成功标准。糖尿病组造模后7 d、15天时分别有1只大鼠死亡。 2、AP0促勃起功能实验 取上述建模成功的糖尿病大鼠,8w后,在颈项皮肤松弛处行皮下注射APO(4 mg APO溶解于0.5 mg/kg的维生素C及生理盐水中,浓度为40μg/ml),剂量100μg/kg。在安静、灯光调暗环境下观察,记录30 min内的勃起次数。以龟头充血及阴茎体增长为阴茎勃起1次。APO诱导未出现阴茎勃起的,可以认为是糖尿病性ED模型。 3、细胞培养 取正常组、糖尿病性勃起功能障碍组、糖尿病性勃起功能正常组各2只大鼠,在无菌条件下切取其阴茎海绵体组织在一定条件下行元代培养,培养至第二代。 4、细胞鉴定 利用免疫细胞化学的方法鉴定阴茎海绵体平滑肌细胞。 5、提取蛋白,wetern-blot技术检测其标志物表达。 提取上述培养的第二代细胞蛋白,利用western-blot技术检测其中收缩型标志物SMA和SMMHC的表达量。wetern-blot步骤(1)、电泳;(2)、转膜;(3)敷一抗;(4)敷二抗;(3)胶片曝光。 6、实时荧光定量PCR实验方法,取正常对照组、糖尿病勃起功能障碍组、糖尿病勃起功能正常组三组大鼠阴茎海绵体组织行实时荧光定量PCR方法检测其中miR145基因。 6.1总RNA抽提(1)液氮研磨组织,加入lml Trizol (Invitrogen)溶液,吹打混匀,使细胞充分裂解,静置5min;2)加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置15min;(3)4℃下,10,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管;(4)沉淀RNA:加入0.5ml异丙醇,轻柔地充分混匀,室温静置10min;(5)4℃下,10,000g离心10min,收集RNA沉淀,去上清;(6)用75%乙醇洗涤两次,超净台风干;(7)加入15~40μl DEPC水溶解沉淀。 6.2去基因组使用RNase-free的DNase I (Takara),37℃C消化30min,65℃灭活10min。然后按以下步骤操作:(1)加入等体积的苯酚,上下颠倒混匀后10,000rpm,离心5min,取上清;(2)加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀后10,000rpm,离心10min,取上清;(3)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀,-20℃静置15min(4)4℃下,10,000g离心10min,收集RNA沉淀,去上清;(5)用75%乙醇洗涤两次,超净台风干;(6)加入15-40μl DEPC水溶解沉淀。 6.3总RNA纯度和完整性检测(1)纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在Beckman Coulter DU(?) 520UV/Vis Spectrophotometer上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染;(2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。 6.4逆转录(使用茎环法) (1)在去RNase的PCR管中配置0.3ug total RNA、11.7ul H2O;(2)将上述溶液混匀,72℃C孵育5min,以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;(3)在另一去RNase的PCR管中配置2.0ul 10mMdNTP、0.5ul RNase inhibitior、0.5ulmiRs逆转录引物、0.5ul U6逆转录引物,4.0ul 5x RT buffer、0.5ul M-MLV;(4)将(3)溶液加入到(1)溶液中,混匀后42℃C孵育50min;(5)72℃孵育10min灭活逆转录酶。 6.5定量PCR(1)检测序列片段大小:内参片段:U6-94bp;目的片段:hsa-miR-145:72bp; (2)反应体系cDNA (1:5) 5.0μl、上游引物(5'-TGCTGAAGAACGAGCAGTAA-3') 0.5μl,下游引物(5'-CGAGGTCCGAAGACTCATTT-3') 0.5nl、2x SYBR Green PCR Master Mix 0.5μl、H2O 4.0ul;(3)反应条件:上述反应体系置于95℃5min,然后95℃15s后分别于72℃20s后读板与65℃C30s循环40次后,再于72℃20s读板,溶解曲线分析:温度72℃-90℃每个样本重复三次。 7、对western-blot的条带分析及对qRT-PCR数据中的CT、ΔCT、ΔΔCT和2-△△CT进行统计学分析,然后对照三组数据的变化,特别是2-△△CT组数据的变化,进而说明miR-145在三组中表达量的改变。 结果 1糖尿病大鼠体质量及血糖测定结果 糖尿病造模后7 d、15天时分别有1只大鼠死亡;造模后2周,正常对照组大鼠毛色光滑;糖尿病模型组大鼠每日饮水量及尿量均明显增加,毛色失去光泽,眼睛变灰暗,消瘦明显。其中糖尿病组质量较对照组质量明显减轻(P0.01),血糖明显升高(P0.01)。 2阿朴吗啡(APO)筛选实验结果 正常对照组大鼠应用APO 100μg/kg后,有10只阴茎勃起实验均呈阳性;其余2只观察时间内未见勃起,去除。上述12只成模的糖尿病大鼠阴茎勃起实验阳性7只,其余5只为阴性。 3、细胞鉴定结果,可根据免疫细胞化学相关图片验证。 4、western-blot结果,可根据条带的明暗度来确定SMA和SMMHC表达量在三组细胞中的高低。 5实时荧光定量PCR结果 miRl45基因qrt-PCR结果数据分析,数据以均数±标准差表示(x±s),根据2-△△Ct确定目的基因的量,正常组大鼠CT值为16.32±0.77,△CT值为5.25±0.79,△△CT值为-3.69±0.78,2-△△Ct值为14.76±8.82;糖尿病性阴茎海绵体勃起功能正常大鼠组CT值为16.31±0.34,△CT值为5.39±0.44,△△CT值为-3.55±0.45,2△△Ct值为12.11±3.31;糖尿病性阴茎勃起功能障碍大鼠组CT值为18.03±0.66,△CT值为7.42±0.98,△△CT值为-1.53±0.99,2-△△Ct值为3.41±1.77,2-△△Ct比较,非糖尿病勃起功能正常组VS糖尿病勃起功能正常组(P0.05),非糖尿病勃起功能正常组VS糖尿病勃起功能障碍组(P0.05),糖尿病勃起功能障碍组VS糖尿病勃起功能正常组(P0.01)。


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