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低分子肝素在治疗子痫前期中的抗炎及抗凋亡作用研究

张园  
【摘要】:子痫前期是导致孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一,虽然滋养细胞浸润表浅及子宫螺旋动脉重铸障碍是目前被广泛接受的一种学说,但其发病机制仍不清楚。近年来有研究发现,免疫失调导致的过度炎症反应及细胞凋亡等与子痫前期的发病有关。如何找到一种治疗方法可以在保证母体安全的同时尽可能延长孕周,降低早产儿各种并发症发病率是所有临床医生关注的主要问题。低分子肝素因其安全有效的抗凝作用在临床得到广泛应用,但随着对其研究深入,发现低分子肝素还具有抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等作用。低分子肝素在易栓症引起的产科疾病治疗中的作用已经被国内外学者肯定,主要是在易栓症引起的复发性流产方面。但近年来国外有学者发现,低分子肝素不仅对易栓症引起的复发性流产有效,对非易栓症所致的复发性流产具有同样好的疗效,因此提出低分子肝素在治疗过程中可能还发挥了抗凝以外的其他作用。在国内低分子肝素因其有效的抗凝作用还被尝试应用于子痫前期的治疗,且取得了很好的疗效,但值得注意的是,在临床应用低分子肝素时并未明确区分是否由易栓症引起的子痫前期,也同样都可以有效改善临床症状及预后,因此推断,低分子肝素在治疗子痫前期时除了抗凝改善微循环以外,可能还发挥了其他作用。因此,我们设计本实验,通过动物模型,从抗炎及抗凋亡两方面探讨低分子肝素在治疗子痫前期中的作用机制,为低分子肝素的临床应用提供理论依据。 第一部分子痈前期样孕鼠模型的建立及低分子肝素疗效评价 [目的] 使用一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂—左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)建立子痫前期样孕鼠模型,从血压、尿蛋白子代结局等方面评价低分子肝素在治疗子痫前期样孕鼠中的疗效。 [方法] 1.子痫前期样孕鼠模型建立:自妊娠第13-16天给予L-NAME 200mg/Kg.d皮下注射,妊娠第15天无创测量血压,若较孕前血压升高30mmHg或以上则为建模成功。 2.实验分组:取Wistar大鼠40只,随机分为4组:正常非孕组、正常孕组、PIH组及LMWH组,每组大鼠10只。正常非孕组:实验第13-20天给予生理盐水皮下注射;正常孕组:妊娠第13-20天给予生理盐水皮下注射;PIH组:妊娠13-16天给予L-NAME 200mg/kg.d皮下注射,妊娠第17-20天给予生理盐水皮下注射;LMWH组:妊娠13-16天给予L-NAME200mg/Kg.d皮下注射,妊娠第15-20天给予低分子肝素40ul/kg.d皮下注射。 3.血压、尿蛋白及肝肾功能测量:采用无创鼠尾血压检测方法,分别于孕前、妊娠第15天及妊娠第21天测量血压;收集妊娠第1天及妊娠第20天24小时尿液进行尿蛋白定量分析;妊娠21天留取外周血,进行血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及ALT检测。 4.子代结局评价:妊娠第21天剖宫术取出鼠胎、胎盘,计数正常鼠胎数,并称取鼠胎及胎盘重量。 [结果] 1.血压:孕前正常非孕组、正常孕组、PIH组及LMWH组大鼠血压无显著性差异(P0.05),妊娠第15天时PIH组及LMWH组血压较孕前均显著升高(P0.05),也显著高于正常非孕组及正常孕组(P0.05),妊娠第21天PIH组大鼠血压继续维持在高水平,与妊娠15天无显著性差异,而LMWH组妊娠21天血压较妊娠第15天显著下降(P0.05),且显著低于PIH组(P0.05),但较正常孕鼠仍显著升高(P0.05); 2.尿蛋白:妊娠第一天24小时尿蛋白定量在四组大鼠之间无显著性差异,妊娠第20天,PIH组尿蛋白显著高于正常孕组及正常非孕组(P0.05),LMWH组则显著低于PIH组(P0.05),但仍显著高于正常孕组及正常非孕组(P0.05); 3.肝肾功能:PIH组BUN及Cr均显著高于正常孕组及正常非孕组,LMWH组BUN及Cr则较PIH组显著降低,但仍较正常孕组显著升高(P0.05),PIH、LMWH组ALT与正常孕组无显著性差异,PIH及LMWH组之间也无显著性差异(P0.05); 4.子代结局:PIH组鼠胎数、鼠胎重量均显著低于正常孕组,LMWH组在接受LMWH治疗后,鼠胎数及鼠胎重量均较PIH组显著升高(P0.05),但仍显著低于正常孕组(P0.05),PIH及LMWH组胎盘重量均显著低于正常孕组(P0.05),但PIH及LMWH组之间无显著性差异(P0.05)。 [结论] 自妊娠第13-16天给予L-NAME 200mg/kg.d皮下注射可以充分模拟子痫前期主要症状,成功建立子痫前期样孕鼠模型,给予低分子肝素治疗后可以有效改善子痫前期样症状,改善子代结局。 第二部分低分子肝素治疗子痫前期中的抗炎作用研究 [目的] 使用不同方法分别检测外周血及各组织中Th2型抗炎因子(IL-4、IL-10)及Thl型促炎因子(IL-2、INF-γ)含量,比较低分子肝素治疗后各因子变化情况,探讨低分子肝素在治疗子痫前期中的抗炎作用。 [方法] 1.实验分组:取Wistar大鼠40只,随机分为4组:正常非孕组、正常孕组、PIH组及LMWH组。正常非孕组:D13-20给予生理盐水皮下注射;正常孕组:D13-20给予生理盐水皮下注射;PIH组:D13-16给予L-NAME 200mg/kg.d皮下注射,D17-20给予生理盐水皮下注射;LMWH组:D13-16给予L-NAME200mg/Kg.d皮下注射,D15-20给予低分子肝素40ul/kg.d皮下注射。 2.标本留取:妊娠第21天处死大鼠,处死前留取外周血,离心后血清备用,剖宫取出胎盘,同时取出肾脏及脾脏,均修剪后分为两部分,一部分10%福尔马林浸泡固定后进行脱水、石蜡包埋,另一部分迅速置于液氮中然后转入-80度保存。 3.细胞因子检测:外周血离心后取血清进行Elisa法检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-10及INF-γ水平;胎盘、肾及脾组织进行固定包埋切片,然后使用免疫组化方法检测IL-2、IL-4、IL-10及INF-γ表达;荧光定量PCR方法检测胎盘、肾脏及脾脏组织中IL-2、IL-4、IL-10及INF-γmRNA水平;Western blot法检测胎盘、肾脏及脾脏组织中IL-2、IL-4、IL-10及INF-γ蛋白表达。 [结果] 1.Elisa法检测外周血中各种细胞因子含量:结果显示,正常孕组IL-2及INF-γ较正常非孕组显著降低,而IL-4及IL-10显著升高(P0.05);PIH组IL-2及INF-γ较正常孕组显著升高,而IL-4及IL-10显著降低(P0.05);LMWH组IL-2及INF-γ较PIH组显著降低但仍显著高于正常孕组(P0.05),IL-10显著高于PIH组,仍较正常孕组显著降低(P0.05),IL-4与PIH组相比无显著差异(P0.05)。 2.免疫组化法检测胎盘组织中IL-2、IL-4、IL-10及INF-γ:结果发现正常孕组肾脏及脾组织中IL-2及INF-γ含量均较正常非孕组显著降低,而IL-4及IL-10则显著升高(P0.05);PIH组胎盘、肾脏及脾脏组织中IL-4、IL-10较正常孕显著降低,IL-2及1NF-γ显著高于正常孕组(P0.05);LMWH组IL-10较PIH组显著升高,而IL-4无显著改变,IL-2及INF-γ则显著降低(P0.05)。 3.荧光定量PCR法检测各组织中细胞因子mRNA:对各组大鼠胎盘、肾脏、脾脏组织研究发现,正常孕组IL-4及IL-10mRNA显著高于正常非孕组,而IL-2及INF-y则显著降低(P0.05)。PIH组IL-2及INF-γ较正常妊娠组显著升高(P0.05),IL-4、IL-10显著降低(P0.05),LMWH组在LMWH治疗后IL-10较PIH组显著升高(P0.05),IL-2及INF-γ显著降低(P0.05),IL-4较PIH组无显著性差异(P0.05)。 4. Western-blot法比较各组组织中细胞因子表达情况:与正常非孕组相比,正常孕组大鼠各组织IL-4及IL-10蛋白表达均显著升高(P0.05),而IL-2及INF-γ均显著降低(P0.05);PIH组IL-4及IL-10蛋白含量显著低于正常孕组(P0.05),IL-2及INF-γ显著升高(P0.05),LMWH组在接受LMWH治疗后与PIH组相比,IL-10蛋白含量显著升高(P0.05),IL-2及INF-γ显著降低(P0.05),IL-4变化无显著意义(P0.05)。 [结论] 本实验建立子痫前期样动物模型表现出Thl型促炎因子增多,Th2型抗炎因子减少,Th1/Th2平衡向Th1漂移现象,与人类子痫前期时改变相似。低分子肝素在治疗子痫前期样大鼠模型时,可以减少促炎因子(IL-2及INF-γ),增加抗炎因子(IL-10),发挥抗炎作用。 第三部分低分子肝素治疗子痫前期中的抗凋亡作用研究 [目的] 低分子肝素具有抗凋亡作用,而细胞凋亡在子痫前期发病中起一定作用,本研究通过观察低分子肝素对子痫前期样大鼠模型胎盘及肾脏细胞凋亡的作用,探讨低分子肝素在治疗子痫前期中的抗凋亡作用。 [方法] 1.实验分组:取Wistar大鼠40只,随机分为4组:正常非孕组、正常孕组、PIH组及LMWH组。模型建立及给药方法均同第二部分。 2.标本收集:妊娠第21天处死大鼠,剖宫取出胎盘,同时取出肾脏,均修剪后分为两部分,一部分10%福尔马林浸泡固定后进行脱水、石蜡包埋,另一部分迅速置于液氮中然后转入-80度保存。 3.细胞凋亡检测:组织石蜡包埋切片后进行TUNEL法原位检测胎盘、肾脏组织中细胞凋亡,同时提取组织中蛋白,使用Western blot法检测组织中活化Caspase-3、Bcl-2及Bax在上述组织中的表达水平。 [结果] 1.TUNEL法原位检测细胞凋亡:正常胎盘组织中存在细胞凋亡,但PIH组胎盘细胞凋亡数较正常孕组显著升高,给予LMWH治疗的LMWH组凋亡数较PIH组显著降低(P0.05),与正常孕组间无显著性差异(P0.05)。在正常非孕大鼠肾脏中细胞凋亡较少,正常孕组则较其显著升高,PIH组较正常孕组显著升高(P0.05),LMWH组较PIH组显著降低(P0.05),与正常孕组无显著性差异(P0.05)。 2.Western-blot法检测胎盘及肾脏组织中活化Caspase-3、Bcl-2及Bax含量:结果发现PIH组大鼠胎盘活化Caspase-3及Bax蛋白含量较正常孕组显著升高(P0.05),Bcl-2显著降低(P0.05),LMWH组活化Caspase-3及Bax比PIH组显著减少(P0.05),Bcl-2显著增多(P0.05)。肾脏组织中,正常孕组活化Caspase-3及Bax均较正常非孕组显著升高(P0.05),但Bcl-2也同时显著升高(P0.05),PIH组活化Caspase-3及Bax则较正常孕组显著升高(P0.05),Bcl-2显著降低(P0.05),同样,LMWH组活化Caspase-3及Bax比PIH组显著降低(P0.05),而Bcl-2显著升高(P0.05)。 [结论] L-NAME建立子痫前期样模型孕鼠胎盘及肾脏组织中细胞凋亡均显著增加,而给予LMWH治疗后可以显著减少细胞凋亡。低分子肝素在治疗子痫前期时可能通过增加Bc1-2、减少Bax发挥抗凋亡作用。


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