尿液组织因子促凝活性检测方法的建立及其在糖尿病肾病中的应用研究

【摘要】：研究背景和目的 随着人们生活水平的不断提高,生活模式现代化,糖尿病(diabetes mellitus, DM)的发病率逐年增加。据统计,中国的糖尿病发病率高达9.7%,患者近一亿,已成为糖尿病第一大国,糖尿病患者的年龄也日趋年轻化,30～45岁年龄层成为发病增长最快阶段。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病中最常见的微血管并发症之一,发病率约为33%,并已成为终末肾功能衰竭的主要原因,也是糖尿病患者致残、致死的主要原因。 DN的发病机制较复杂,目前尚不明确,但普遍认为持续高血糖等引起的肾脏血流动力学改变、糖代谢异常伴蛋白质及脂肪代谢异常是DN病变的基础,而众多生长因素、细胞因子被激活并引起相应生物学效应是DN病变的直接机制。DN在病理上最早表现为肾脏增大,随着病程延长肾小球毛细血管基底膜逐渐增厚、系膜细胞增生、系膜基质增多,进一步发展出现纤维蛋白原呈线样或颗粒样沿基膜沉着,最后可出现典型的肾小球硬化性病变。目前,凝血功能异常、血栓形成倾向等在糖尿病肾病形成和发展中的作用日益受到重视,有研究显示组织因子(Tissue factor, TF)的高表达及其引起凝血功能紊乱与部分肾脏疾病肾小球硬化、肾单位减少的发生有关。 TF,即凝血因子Ⅲ,是外源性凝血系统的启动因子,也是体内活性最强的促凝物质之一,不仅作用于凝血,还与临床的多种疾病密切相关。大量的研究表明DM患者血管内皮细胞TF高表达,外周血浆TF水平显著升高,并与DM多种并发症的发生有关。作为外周血中唯一能表达TF的单核细胞,其TF活性在DM患者中如何改变,是否参与DN的发生尚不得而知。同时如果TF在肾脏内高表达并参与DN病理进程,则可能通过尿液反映出来。因此通过检测尿液TF含量和活性,可了解TF在DN的发生发展中的作用,也可能对DN的早期诊断具有一定的参考价值。本研究旨在建立了一种简便、有效的尿液组织因子促凝血活性(TF procoagulant activity, TF-PCA)检测方法,并探讨2型糖尿病患者尿液TF-PCA、TF抗原含量与糖尿病患者肾功能损伤指标的相关性,了解尿液TF-PCA在DN患者中检测中的价值,为尿TF在DN发病机制中的作用研究提供参考资料。 方法 1.2型糖尿病肾病患者组织因子检测 按照1999年WHO对DM的诊断标准,收集86例2型糖尿病患者的血液、尿液标本。根据尿白蛋白/肌酐比值分成3组：①30 mg/g以下的正常蛋白尿组42例；②30 mg/g比值300mg/g的微量白蛋白尿组26例；③300 mg/g及以上的大量白蛋白尿组18例。另外收集21名健康体检者尿标本作为对照组。Ficoll法分离外周血单个核细胞,PBS调整单个核细胞浓度为200×106/L,于37℃与-70℃反复冻融4次,裂解细胞,采用一期凝固法在STAGO全自动凝血仪上测定外周血单个核细胞TF-PCA, ELISA法检测单个核细胞裂解液、尿液TF抗原含量。常规检测所有参与者空腹血糖、糖化血红蛋白、超敏CRP(Hs-CRP)、尿酸(UA)、胱抑素C (CYSC),以Macisaac公式估算肾小球滤过率(eGFR)。比较外周血单个核细胞TF-PCA、TF含量及尿液TF含量在各组间的差异,并分析TF与这些临床检测指标的相关性。 2.尿液TF-PCA活性检测方法的建立与评价 在STAGO全自动凝血仪上编程并作为检测设备,采用一期凝固法检测尿TF-PCA活性。分析该检测方法中混合血浆来源、混合血浆放置时间,不同稀释液稀释处理、标本储存不同时间等条件改变对尿液TF-PCA测定的影响；并对该检测方法的性能：精密度、准确度、最低检测限和线性范围进行方法学评价。 3.尿液TF—PCA的测定在糖尿病肾病中的应用 采用自建的一期凝固法测定2型糖尿病患者尿液TF-PCA. ELISA法检测尿液肾损伤标志物：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)、肾损伤分子-1(kidney injury molecule 1, KIM-1)、Smadl (drosophila mothers against decapentaplegic protein 1, smad1),以Macisaac公式估算肾小球滤过率(eGFR),常规方法检测空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(glycohemoglobin, HbAlc)、超敏CRP (Hs-CRP)、尿酸(UA)、血脂(包括TG、CHOL、HDL-C、LDL-C)、胱抑素C (CysC)、NAG等指标,以Macisaac公式确定肾小球滤过率(GFR)。分组方法同第一部分。分析各组间尿液TF抗原含量、TF-PCA的差异,及其与肾损伤标志物的相关性。采用ROC曲线确定尿液TF-PCA对DM早期肾损伤的诊断价值。 结果 1.2型糖尿病肾病患者组织因子检测 与正常对照组相比,糖尿病患者外周血单个核细胞TF-PCA、TF抗原含量,尿液TF含量均显著升高；在糖尿病患者三组之间,除正常蛋白组、微量蛋白组两组间无差异外(P0.05),其余各组间均差异显著(P0.05),在大量蛋白尿组升高最为明显,且大量蛋白尿组与肾小球滤过率成负相关,与UACR成正相关。临床研究结果表明,所有2型糖尿病患者单个核细胞TF-PCA、TF抗原含量分别与下列临床指标相关,相关系数分别为：空腹血糖(r=0.263, r=0.393)、Hs-CRP (r=0.498, r=0.367)、HbAlc (r=0.225, r=0.298)、UACR (r=0.370, r=0.272)、UA (r=0.278, r=0.324);而尿液TF抗原含量则与Hs-CRP (r=0.288)、UACR(r=0.332)正相关。 2.尿液TF-PCA活性检测方法的建立与评价 混合血浆对TF-PCA活性的影响：取5人次正常混合血浆标本进行检测,发现混合血浆对测定结果并无显著影响。混合血浆2℃～8℃放置不同时间对测定结果的影响较大,随着混合血浆放置时间的延长,测定PCA凝固时间出现延长,8小时后显著高于即刻(0点),而在4小时内使用对测定结果无明显影响。 尿液TF-PCA检测影响因素分析：以5份不同尿液标本观察不同稀释液对TF-PCA检测的影响,结果owren-koller (STAGO公司配套稀释液)稀释后5份标本凝固时间为197.2±28.6sec,显著低于生理盐水217.0±36.6sec和去离子水231.4±41.8sec结果,表明owren-koller稀释液更适合TF-PCA活性的检测。 TF-PCA测定方法学评价：总不精密度分别为6.98%、5.49%,表明该方法重复性尚可,平均回收率分别为80.8%,最低检测限为5mu/L,并在15-2200 mu/L之间线性良好。 3.尿液TF-PCA的测定在糖尿病肾病中的应用 与正常对照组相比,糖尿病患者尿中TF-PCA均显著升高,且糖尿病患者三组间差异显著(P0.05),在大量蛋白尿组升高最为明显。临床研究结果表明,所有2型糖尿病患者尿液TF-PCA与下列临床指标相关,相关系数为：BUN(r=0.242, P=0.025、CRE(r=0.392, P0.001), CYSC (r=0.240, P=0.026)、hs-CRP(r=0.257,P=0.017).UACR(r=0.430,P0.001),NGAL(r=0.280,P=0.009), smadl(r=0.284, P=0.008), eGFR (r=-0.458, P0.01),与其它测定指标如血脂无相关性。ROC曲线分析表明尿液TF-PCA对糖尿病肾损伤具有一定的诊断价值(AUC=0.847)。 结论 1.本研究显示2型糖尿病患者外周单个核细胞TF-PCA、TF抗原含量,尿液TF抗原含量显著升高,说明糖尿病患者处于高凝状态；TF的高表达参与DN的病理进程。 2.成功建立一期凝固法检测血液及尿液TF-PCA,初步探讨该方法的影响因素,为尿液TF-PCA的深入研究提供依据。 3.2型糖尿病患者尿液TF-PCA、TF抗原均显著升高,尿液TF-PCA与UACR正相关,与GRF负相关,尿液TF-PCA检测具有潜在的临床应用价值。 主要创新点 1.首次观察了DM患者外周血单个核细胞TF-PCA的变化,初步探讨了DM患者高凝状态在DN病理进程中的改变。 2.成功建立了一期凝固法检测尿液TF-PCA,并对该方法的临床应用进行初步方法学评价。 3.检测了DM患者尿液中TF-PCA活性及TF抗原含量,探讨其与肾小球、肾小管损伤标志物的关系及临床应用价值。