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EBNA1在鼻咽癌转移中的作用及分子机制研究

王路  
【摘要】:在鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)发病机制研究中,EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)因与鼻咽癌的发病密切相关而倍受关注,研究证实95%以上未分化型鼻咽癌组织中均可检出EBV感染,因此,EBV在鼻咽癌发生发展中的作用一直是鼻咽癌发病机制研究的重点,也是寻找鼻咽癌早期诊断、治疗新方法、判断预后的突破点。 鼻咽癌细胞的EBV感染主要为Ⅱ型潜伏感染,仅表达EBV编码的EB病毒核抗原1 (EB nuclear antigen 1, EBNA1)、潜伏膜蛋白1 (Latent membrane protein-1, LMP-1)、潜伏膜蛋白2 (Latent membrane protein-2, LMP-2)及EB病毒编码小RNAs (Epstein-Barr viral encoded RNAs, EBERs)。目前的研究表明,EBNA1的作用主要是调节EBV基因的复制,增强病毒基因的转录,维持病毒附加子的存在;另外也可与EBV潜伏感染时的复制起始点(Origin of replication,Orip)中的重复序列家族(Family of repeats, FR)结合,激活LMP1的启动子,促进其转录。在我们另一课题研究中,试图通过EBNA1靶向基因治疗鼻咽癌,在培养EBNA1过表达鼻咽癌细胞株时我们意外发现,在培养到一定代数的时候,这个细胞从原来典型的鹅卵石形状变成梭形,类似于成纤维细胞的形态,这个惊喜的发现,使我们推测到EBNA1基因是否引起鼻咽癌细胞发生上皮细胞间质转化。因鼻咽癌发病的地域性限制,国外对于鼻咽癌中EBNA1的研究甚少,仅局限于病毒学领域,而国内的研究多集中于EBNA1作为一个诊断指标在鼻咽癌患者血清中的检出价值讨论,并没报告EBNA1对鼻咽癌细胞有直接作用,深入探讨EBNA1对鼻咽癌细胞的作用,对了解EB病毒在鼻咽癌中的发病作用,分析鼻咽癌的发病机制,寻找治疗鼻咽癌的新途径都有积极的意义。 上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions, EMT)是指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变,并获得迁移能力,它是一种基本的生理病理现象,在胚胎发育、组织发生中起重要作用。此外,EMT也存在于多种病理过程中,如伤口愈合过程、肾脏纤维化、肿瘤发生及转移。越来越多的研究显示EMT在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用,肿瘤细胞从原发部位游离是转移最初始步骤,也是转移发生的先决条件,近年来EMT是肿瘤转移机制研究的热点。 基于我们在培养EBNA1过表达鼻咽癌细胞株时的意外发现,本研究将探讨EBNA1对鼻咽癌细胞的直接作用;EBNA1是否通过EMT参与鼻咽癌转移;EBNA1参与EMT途径及机制。 方法: 1.鼻咽癌组织中EBNA1的检测:选取2006-2010年南方医院耳鼻喉科头颈肿瘤标本库中鼻咽癌组织标本48例,慢性鼻咽炎12例作为对照。常规石蜡包埋,免疫组织化学法检测EBNA1表达。 2. EBNA1表达变化对鼻咽癌细胞株转移能力的影响: 2.1过表达或沉默EBNA1鼻咽癌细胞株的构建: 利用lipofectamine2000转染含EBNA1编码片段的pCEP4质粒入CNE1、CNE2、5-8F细胞,转染48小时后加300μg的潮霉素B(终浓度150μg/ml)进行抗性筛选,2周后形成单细胞克隆,潮霉素B半量维持培养。通过荧光定量PCR和Western Blotting鉴定EBNA1的转录和翻译水平的表达,构建过表达EBNA1的CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1、5-8F/EBNA1细胞。 将化学合成的转录EBNA1干扰模板的双链DNA片段shRNA EBNA1(以下简称shEBNAl)插入shRNA的表达载体pAVU6+27,获得pAVU6+27/shEBNA1重组质粒,将此质粒的U6+shEBNA1片段克隆至克隆载体pBlueScript SK+(以下简称BSSK),获得BSSK/shEBNA1重组质粒,再从该质粒中将U6+shEBNA1片段克隆至慢病毒载体pLVTHM中,获得pLVTHM/shEBNA1质粒。 将慢病毒载体质粒(pLVTHM或带有目的片段的pLVTHM/shRNA EBNA1)与辅助质粒(psPAX2质粒,pMD2.G质粒)共转染,按lipofectamine2000说明书包装慢病毒LV/Control和LV/shEBNA1。将此两种慢病毒分别感染CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1细胞,获得携带绿色荧光蛋白的CNE1/EBNA1、Control、CNE1/EBNA1/shEBNA1、和CNE2/EBNA1/Control、CNE2/EBNA1/shEBNA1四株细胞。荧光定量PCR和Western Blotting检测四株细胞中EBNA1表达情况。 2.2过表达或沉默EBNA1对鼻咽癌细胞株转移功能的影响: 利用划痕实验检测EBNA1对鼻咽癌细胞迁徙能力的影响;利用侵袭小室检测EBNA1对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响;利用平板克隆形成实验检测EBNA1对细胞低浓度下增殖能力的影响。 3.EBNA1诱导鼻咽癌发生EMT: 3.1 EBNA1和EMT标志物在鼻咽癌组织中的表达及其相关性:免疫组化检测48例鼻咽癌和12例慢性鼻咽炎组织中EMT上皮标记物(CK18)与间质标记物(Vimentin)蛋白的表达情况,分析其与EBNA1相关性。 3.2 EMT标志物在鼻咽癌细胞中的检测:在过表达EBNA1及其相应对照的3组鼻咽癌细胞中应用荧光定量PCR、Western Blotting、免疫荧光染色法检测EMT上皮标志物(E-cadherin、CK18)与间质标志物(Vimentin、β-catenin和N-cadherin)的(?)mRNA和蛋白水平表达情况。 4.EBNA1参与鼻咽癌EMT的可能信号通路:运用荧光定量PCR对TGF-β1/Smad.Wnt/β-catenin两条信号通路上的相关基因及转录抑制因子ZEB1、ZEB2进行检测,验证EBNAl对其表达变化的影响。 结果: 1. EBNA1在鼻咽癌组织中的高表达促进鼻咽癌转移: 免疫组化结果显示EBNA1在鼻咽癌组织中的阳性率为87.5%(42/48),慢性鼻咽炎组织中EBNA1均未检出(0/12),两组间差异有统计学意义(Z=-4.823,P=0.000)。EBNA1在不同N分期中表达有显著统计学差异(X2=14.174,P=0.003),伴颈部淋巴结组的EBNA1表达高于未伴淋巴结转移组(Z=-2.713,P=0.007),且在N3组中,EBNA1的表达明显高于N2和N1组。EBNA1的表达在不同临床分期(X2=17.219,P=0.000)和不同T分期(X2=10.047,P=0.018)中,随着分期数增高而表达增高。 2. EBNA1基因过表达及沉默后对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 2.1建立稳定表达EBNA1的鼻咽癌细胞株: 经潮霉素抗性筛选得到过表达EBNA1的三株鼻咽癌细胞株:CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1、5-8F/EBNA1。荧光定量PCR和Western Blotting在mRNA和蛋白水平均可检测到EBNA1表达,其中以5-8F/EBNA1中的表达最高。 2.2过表达EBNA1促进鼻咽癌细胞移动,增强侵袭性及低浓度下增殖能力: 划痕实验结果显示:划痕后12小时、24小时,在CNE1组(F=68.295,P=0.000)、CNE2组(F=24.242,P=0.000)和5-8F组(F=80.977,P=0.000)中,过表达EBNA1细胞较相应对照组细胞的移动能力均增强,尤其对于CNE1细胞株,过表达EBNA1后使其移动能力增强3.65倍(12小时)和2.75倍(24小时),而在CNE2和5-8F组,过表达EBNA1后移动能力分别增加了1.5倍和2.5倍。 侵袭实验结果表明:本身具有转移能力的CNE2和5-8F细胞均可见细胞穿透Matrigel,进一步过表达EBNA1后,其穿透能力更分别增强2.11倍和3.92倍。而本身不具有转移能力的CNE1细胞(仅极少数细胞透过Matrigel),穿透力更增强4.24倍。三组细胞中过表达EBNA1的细胞较相应对照细胞侵袭力明显增强(CNE1组:t=-6.506,P=0.000;CNE2组:t=-7.834,P=0.000;5-8F组:t=-12.498,P=0.000)。 平板克隆形成实验提示:在种植后14天,过表达EBNA1组克隆形成数较相应对照组增加至2.44、2.00和2.10倍(CNE1组:t=-2.848, P=0.046; CNE2组:t=-2.961,P=0.042;5-8F组:t=-11.015,P=0.000)。 2.3建立稳定沉默EBNA1的鼻咽癌细胞株: 双酶切及DNA测序结果表明,我们成功获得含有shEBNA1的慢病毒干扰载体,包装慢病毒后感染CNE1/EBNA1和CNE2/EBNA1细胞株荧光显微镜下观察GFP阳性率达90%以上;荧光定量PCR和Western blot结果证实EBNA1的表达在干扰亚株较对照组下调70%-80%不等。 2.4沉默EBNA1减慢鼻咽癌细胞移动,抑制侵袭性及低浓度下增殖能力: 划痕实验结果表明:沉默EBNA1在12小时和24小时均减慢鼻咽癌细胞移动能力(CNE1/EBNA1组F=8.816, P=0.000; CNE2/EBNA1组:F=7.258,P=0.002),沉默EBNA1后使其移动能力分别下降了50-60%不等。 侵袭实验结果显示:沉默EBNA1降低鼻咽癌细胞的侵袭力(CNE1/EBNA1组:t=7.174, P=0.000; CNE2/EBNA1组:t=9.111,P=0.000),两组细胞侵袭力分别下降了66%-72%不等。 平板克隆形成实验结果提示:沉默EBNA1后,CNE1/EBNA1组形成克隆数由78.000±12.000降低为41.667±12.342(t=3.656,P=0.022),下降了46%;CNE2/EBNA1组细胞数由101.333±9.292降低为49.333±14.012(t=5.357,P=0.006),减少了52%。 3. EBNA1诱导鼻咽癌发生EMT: 3.1 EBNA1对鼻咽癌细胞株形态学影响: 经潮霉素抗性筛选后,5-8F细胞株由原本的圆形变为狭长的梭形,CNE1细胞株由原本的圆形变为多边形,边缘伸出长角,而CNE2细胞株则更加异型性明显,由原本的圆形变为不规则多边形,触角伸长。而在CNE1/EBNA1、CNE2/EBNA1的基础进行了EBNA1干扰后发现,相对于对照组,干扰后的细胞又有大部分再次回缩为原始的圆形,说明过表达EBNA1后可使鼻咽癌由上皮细胞向间质细胞转化,而干扰EBNA1后则可逆转该过程。 3.2 EBNA1的表达与EMT标志物的关系: 3.2.1 EBNA1在鼻咽癌组织中与CK18呈负相关,与Vimentin呈正相关: 在鼻咽癌组织中,上皮标志物CK18的阳性率达到70.83%(34/48),在慢性鼻咽炎中,CK18的阳性率为50%(6/12)。在鼻咽癌和慢性鼻咽炎中CK18的表达无统计学差异(Z=-0.720,P=0.471)。但是在鼻咽癌组织中,CK18的表达在鼻咽癌的T分期、N分期及临床分期的不同组中均有显著统计学差异(T分期:X2=13.985,P=0.003;N分期:X2=10.349,P=0.016;临床分期:X2=21.080,P=0.000)。同时,随着鼻咽癌的各分期数的增高,CK18的平均秩次呈下降趋势。 在鼻咽癌组织中,间质标志物Vimentin的阳性率79.17%(38/48),在慢性鼻咽炎中,Vimentin的阳性率66.67%(8/12)。Vimentin在慢性鼻咽炎组织与鼻咽癌组织中表达有统计学差异(Z=-2.428,P=0.015)。而在鼻咽癌组织内,Vimentin在不同N分期中表达有统计学差异(X2=13.064,P=0.005),淋巴结已发生转移的鼻咽癌组织表达高于未发生转移的鼻咽癌组织(Z=-2.228,P=0.026),但是在不同T分期中差异无显著统计学意义(X2=3.756,P=-0.289)。 在鼻咽癌中EBNA1表达与CK表达呈负相关(Correlation Coefficient=-0.331,P=0.021),与Vimentin表达呈正相关(Correlation Coefficient=0.311, P=0.031),而CK18与Vimentin亦呈负相关(Correlation Coefficient=-0.329, P=0.022)。 3.2.2 EBNA1过表达在鼻咽癌细胞株中上调间质标记物,下调上皮标志物: 荧光定量PCR。Western Blotting和免疫荧光染色后激光共聚焦图片分析均显示,过表达EBNA1后,三组鼻咽癌细胞株中上皮标志E-cadherin、CK18T调而间质标志Vimentin。N-cadherin上调。同时,免疫荧光染色显示过表达EBNA1后,β-catenin的表达在部分细胞中由细胞膜转移至细胞核,出现了核聚集现象。 4. EBNA1参与EMT通路研究: 荧光定量PCR法检测结果显示,TGF-β1/SMADs通路中,TGF-β1的表达在三个细胞株中上升了3.75倍(CNE1)、1.57倍(CNE2)、25.49倍(5-8F), Smad4平均升高了2.43倍(CNE1)、1.64倍(5-8F),而在CNE2细胞中Smad4变化不明显。说明在CNE1和5-8F细胞株中,EBNA1在转录水平可能与TGF-β1/Smad通路相关。 对于Wnt/β-catenin通路中的GSK-3β及其调控的下游c-myc的检测我们发现,过表达EBNA1后GSK-3β的表达在三个细胞株中平均升高了1.58倍(CNE1)、1.47倍(CNE2),8.70倍(5-8F), c-myc上调了1.21倍(CNE1)、61.98倍(5-8F)。结合E-cadherin下调、β-catenin上调的结果,说明EBNA1在转录水平与Wnt/β-catenin通路相关。 另外,过表达EBNA1后转录抑制因子ZEB1的mRNA水平表达在过表达EBNA1后分别上调2.92倍(CNE1)、2.83倍(CNE2)、381.01倍(5-8F),ZEB2平均升高了3.78倍(CNE1)、1.83倍(CNE2)、65.39倍(5-8F),说明EBNA1在转录水平与转录抑制因子ZEB1、ZEB2相关。 结论: 1.EBNA1在鼻咽癌组织中高表达,表达水平与鼻咽癌的T分期、N分期和临床分期相关;EBNA1的表达在鼻咽癌中亦与上皮标志物(CK18)呈负相关,与间质标志物(Vimentin)呈正相关; 2. EBNA1的过表达可促进鼻咽癌细胞体外的移动、侵袭及低浓度下增殖能力,使鼻咽癌细胞转移能力增强;沉默EBNA1可抑制移动、侵袭和低浓度下增殖能力,使鼻咽癌细胞转移能力下降; 3. EBNA1诱导鼻咽癌细胞发生EMT,可能通过TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin信号通路及ZEB1、ZEB2转录因子参与鼻咽癌EMT过程从而影响其转移能力。


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