模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

【摘要】：研究背景 失重即微重力,是物体只表现为质量而不表现为重量的特殊力学环境(10-6-10-9g)。在失重飞行引起的一系列人体生理系统变化中,其他生理系统的变化在航天飞行中会达到一种新的平衡状态,返回地面后,经过一段时间可以很快恢复。但骨钙的丢失却持续发展,引起失重性骨质疏松。骨代谢的调节失衡是影响宇航员健康的主要问题。目前国内外研究表明失重性骨质疏松的骨丢失主要是由于骨形成的减少而不是骨吸收的增加。目前航天中采用的各种对抗措施均未能起到理想的效果,为了探求更有效的预防、治疗失重性骨丢失方法,失重状态下机体的骨代谢和骨细胞代谢变化是的的研究已成为国内外航天医学领域的重点和热点课题。 目前研究表明胰岛素样生长因子I (IGF-1)的水平与骨质疏松的的发生有密切联系。骨质疏松、糖尿病合并骨质疏松患者血生长激素(GH)、IGF-1水平下降。国外临床流调研究结果表明肥胖、糖尿病合并骨质疏松、绝经后女性伴有骨质疏松者其血IGF-1、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)下降,甲状旁腺激素(PTH)、骨吸收的标志物水平升高,骨形成的标志物水平下降,骨量和骨密度下降。低血清IGF-1伴随着髋骨骨折发生的危险增加。动物实验、成骨细胞离体研究结果显示：IGF-1可以以自分泌的形式刺激骨胶原、骨基质的合成,促进成骨细胞(OB)的存活,抑制细胞凋亡。在鼠骨组织,IGF-1调节I型胶原蛋白(?)mRNA处于稳定状态,对骨前胶原蛋白的表达有重要的影响。同时IGF-1抑制间质中胶原酶转录,减少骨胶原降解,维持骨量。IGF-1是维持骨量和促进骨细胞生长的重要因子。本课题是研究大鼠成骨细胞离体模拟失重状态与降钙素(CT)的干预下IGF-1等基因表达的变化与OB增殖、分泌等功能变化。为进一步探讨模拟失重状态下成骨细胞的基因、蛋白水平的变化提供一定的实验依据。 目的 观察降钙素对成骨细胞在体外模拟失重状态下的功能及其胰岛素样生长因子-1基因表达的影响。 对象和方法 1.OB的分离、培养、扩增：取才1d SD大鼠乳鼠颅骨作OB原代培养。依据贴壁培养法分离和扩增成骨细胞,噻唑蓝比色法(MTT)法检测原代细胞细胞增殖率绘制细胞生长曲线,取前4-6代细胞作为研究对象。 2.OB功能鉴定：采用碱性磷酸酶(ALP)染色、矿化结节诱导液诱导矿化结节观察。 3.构建海藻酸钠成骨细胞微囊：配置1.0×106个/mIOB、2%海藻酸钠细胞悬液,滴入CaCl2中交联形成海藻酸钠成骨细胞微囊。 4.实验分组：实验分为：正常重力组、模拟失重组、模拟失重+CT组(10IU/L,40 IU/L,80 IU/L)。正常重力组在正常重力下培养72h,模拟失重组和模拟失重+CT组(10 IU/L,40 IU/L,80 IU/L)均在旋转式生物反应器中模拟失重培养72h。细胞培养72小时后,实验各组均以25mM柠檬酸钠溶液37℃溶解海藻酸钠微包囊,离心收集OB进行检测。 5.观察各组培养72小时后MTT法检测OB的增殖率、培养基中碱性磷酸酶活性检测、Hoechst染色检测凋亡小体、两步法RT-PCR(半定量反转录-聚合酶链反应)检测IGF-1、ALP、骨钙素(oc)基因的mRNA表达情况。 6.统计学数据采用SPSS13.0进行统计分析,实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组均数比较采用两独立样本均数比较的t检验,多组均数比较采用完全随机设计资料的方差分析,LSD法进行多样本均数两两比较,方差齐性采用Levene检验。P0.05具有统计学意义。 结果 1.OB生长情况：经“两步消化培养法、差速贴壁法”提取、纯化的OB,在相差显微镜下呈三角形、菱形形状,透明度好。细胞有触突,胞浆丰富并向外伸展,伸出几个突起与临近细胞伸出的突起相连,有聚集成团(集落)的现象。胞核大而清楚,呈圆形或卵圆形,含1～2个核仁。组织块培养法第3天,倒置显微镜下可见大量成骨细胞从骨块周边爬出,培养第5天,移出的细胞明显增加,以骨块为中心,向周围呈放射生长,间杂成纤维细胞后期用差异贴壁法分离纯化。7天后细胞基本铺满单层,呈“卵石街”状。长满瓶底时,细胞为梭形及立方块状,排列紧密,可见圆形或鳞片形细胞。 2.细胞活力测定：MTT法绘制细胞增殖率生长曲线,取处于对数生长期的4-6代细胞进行试验。 3.成骨细胞的鉴定 (1)钙-钴法染色：细胞ALP染色显示呈强阳性,细胞胞浆内可见灰、黑颗粒定位于酶活性之处,证明细胞内有活性ALP的表达。 (2)体外矿化能力检测：10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L维生素C矿化结节诱导液诱导培养成骨细胞诱导矿化结节。细胞生长至3、4周后可见细胞呈复层状生长,中心部细胞密集可发生钙化,形成肉眼可见的散在白色点状物。 4.OB的增殖情况：与正常重力组比较,差异有统计学意义(P0.01),模拟失重组成骨细胞的细胞增殖率降低。与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组的细胞增殖率差异有统计学意义(P0.05),模拟失重+降钙素组细胞增殖率升高,无剂量依赖效关系。 5.OB培养液中的的碱性磷酸酶活性：与正常重力组比较,模拟失重组培养基的碱性磷酸酶活性差异有统计学意义(P0.01),模拟失重组培养基的碱性磷酸酶活性降低。与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组培养基中的碱性磷酸酶活性差异有统计学意义(P0.05),模拟失重+降钙素组培养基中的碱性磷酸酶活性升高,无剂量依赖效关系。 6.OB的凋亡情况：hoechest染色显示：正常重力下培养的OB染色质分布均匀,为弥漫均匀的低强度荧光；而在模拟失重条件下培养的OB(包括模拟失重组和CT加药组)都观察到凋亡细胞较多,细胞呈致密固缩状或颗粒荧光状。提示成骨细胞在模拟失重条件下培养出现细胞核浓缩、染色质凝集、DNA片段化、细胞发生凋亡。模拟失重与模拟失重+CT加药组之间无显著差异。 7.OB的IGF-1、OC、ALP的mRNA的表达：RT-PCR结果显示：与正常重力组比较,模拟失重组和模拟失重+降钙素组的IGF-1、OC、ALP的mRNA表达均下降,模拟失重+降钙素组较模拟失重组IGF-1、OC、ALP的mRNA表达增加。 结论 1.“两步消化-差速贴壁法”原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效、经济的成骨细胞原代培养方法。 2.体外模拟微重力培养OB降低了OB细胞活性,使骨基质形成、成熟和矿化作用均降低；成骨细胞增殖率显著下降。下调了IGF-1、ALP、OC基因的mRNA表达。 3.降钙素可以部分逆转模拟失重状态对成骨细胞的抑制作用,增加成骨细胞在模拟失重状态下的细胞活性,增加IGF-1、ALP、OC基因的mRNA表达。